EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种广泛 存在的疱疹病毒，主要以B淋巴细胞为靶细胞， 导致靶细胞异常增殖引起疾病。有研究表明EBV与各种淋巴和上皮组织恶性肿瘤如伯基特氏淋巴 瘤、鼻咽癌、免疫缺陷病导致的淋巴增生性疾病 和胃癌等密切相关^{[1, 2, 3]}。EB病毒感染人体后将长期 潜伏在B细胞中，多数感染者终身潜伏感染。在体 外早期感染EBV后末梢血B细胞可获得在组织培养 中维持长期生长和增生的能力，称为永生化增殖 细胞（lymphoblastoid cell line，LCL）^[4]。但对 于 感染EBV后末梢血B细胞是否还存在静息B细胞的 形式，目前尚存在争议。

现在国内外关于EB病毒及相关基因与各种疾 病关系的研究较多，但是体内环境下研究EB病毒的感染、增殖、潜伏、激活及致病的机制较少。 体内储存EB病毒的静息B细胞的模型制备，目前 尚未见报道。本实验在前期成功建立套细胞淋 巴瘤模型研究基础上^[5]，采用EB病毒感染末梢血 CD5⁺B细胞建立体内储存EB病毒的静息B细胞模 型，观察EBV阳性的CD+B/EBV病毒潜伏基因、免 疫表型及增殖活性的表达，为预防和治疗EB病毒 相关疾病提供研究基础。1 材料与方法 1.1 材料

EB 病毒B958细胞株由日本冈山大学提供，人 CD5mAb及鼠IgG免疫磁珠购于法国Immunotech公 司；免疫荧光染色试剂盒购于美国Sigma公司；各 种抗体分别购买于加拿大Becton Dickinson,丹麦 Dako,英国Novocastra公司，见表 1。

表1(Table 1)

表1 本研究使用的抗体 Table 1 The antibodies applied in the study

表 1 本研究使用的抗体 Table 1 The antibodies applied in the study

常规 方法脐带血B细胞的分离，取上述所得B细胞1 ml， 加入2 mgCD5mAb，加入1 mg鼠IgG免疫磁珠,室温 孵育10 min，与磁珠作用10 min，清洗收集吸附的 CD5⁺ B细胞。1.2.2 EBV的感染

参照前期研究方法^[5]将NeoR EBV感染的Akata细胞（Akata EBV）上清液作为 EBV使用，Akata EBV感染已分离CD5⁺B细胞用 G418筛选，转染后BrdU标记，将细胞分为CD5⁺B 对照组和CD5⁺B/EBV组。1.2.3 Western blot检测

各组细胞提取蛋白后采 用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝 胶电泳分离蛋白后转至硝酸纤维素膜；加入一抗 （EBNA2和LMP-1），4℃孵育过夜，二抗孵育2 h， TBS洗净后经显色液显示15 min，扫描后图像分析 软件对印迹区进行IOD分析。1.2.4 流式细胞仪分析 检测

各组细胞制备单细 胞悬液，细胞计数，锥虫蓝染色。在试管中加入 一抗（CD20、CD23、CD38、CD80、CD86）孵育 1 h，PBS洗涤，加入二抗孵育30 min，PBS洗涤， 离心3 min，弃上清液，加300 μl PBS，上机检测。1.2.5 免疫荧光染色检测

CD5⁺B/EBV组加入 BrdU培养4 d，参照说明书行EBNA2和BrdU双重染 色，按参照文献^[6]对CD5⁺B/EBV细胞加 Sac、IL-2 和Thiored因子激活18 h后,行BrdU和Ki67及EBNA2 和Ki67抗体双重染色。1.3 统计学方法

所得数据以采用SPSS 13.0软件进行统计学分 析，数据以均值±标准差（x±s）表示，组间比较 采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 CD5⁺B/EBV细胞病毒免疫表型检测

CD5⁺B在EBV病毒感染后，流式细胞仪检测发 现CD5⁺B/EBV诱导CD20、CD80、CD38和CD86表 达增强，但CD23没有表达，见图 1。

图 1 流式细胞仪检测各组细胞免疫表型 CD20、CD23、CD80、CD38和CD86表达 Figure 1 Cell immune phenotypes of CD20,CD23,CD80,CD38 and CD86 in all groups detected by fl ow cytometry

用Akada EBV感染CD5⁺B后，经过G418 筛选， Western blot结果与CD5⁺B细胞比较，CD5⁺B/EBV 细胞中LMP1和EBNA2蛋白相对表达显著增高 (P=0.002，P=0.000），见图 2。

图 2 Western blot检测各组LMP1和EBNA2 蛋白的相对表达 Figure 2 LMP1 and EBNA2 protein expression detected by Western blot in all groups

CD5⁺B/EBV加入BrdU培养了4 d。可见EBNA2阳性的细胞中含有BrdU阴性细胞，见图 3。加 Sac、IL-2、Thiored因子激活18 h，观察到Brdu阴 性细胞中有Ki67阳性细胞存在。而在EBNA2阳性 细胞中观察到Ki67阴性细胞，见图 4。

图 3 免疫荧光染色观察BrdU标记4天后的 CD5+B/EBV细胞情况 Figure 3 CD5+B/EBV cell labeled by BrdU for 4 days detected by immunofl uorescent staining

图 4 免疫荧光染色观察经激活因子激活18 小时后的CD5+B/EBV细胞情况 Figure 4 CD5+B/EBV cell activated by reactivator for 18h detected by immunofl uorescent staining

EB病毒为一种嗜人类B淋巴细胞的γ疱疹病 毒，与宿主细胞关系的特点是潜伏感染。EBV 感 染的主要靶向是人类B淋巴细胞，但病毒还可以感染其他淋巴细胞和上皮细胞^[2]。EB病毒感染人体 后，多数终身潜伏感染。所以，研究EB病毒相关 疾病的发病机制及各种因子的影响，首先要研究 储存EB病毒的静息B细胞及EB病毒相关基因在“感 染-潜伏-激活-致病”等一系列步骤上的作用机制。 EB病毒与宿主细胞关系的特点是潜伏感染。

在体外末梢血B细胞被EBV感染后永生化,表现 EBNAs、EBNA2、LMP-1等潜伏基因变为永生化 增殖细胞株（LCL）^[3]。在EBV健康携带者上EBV 储藏细胞为静息期B细胞，就连免疫缺陷宿主也是 储藏EBV的细胞为静息期B细胞^[7]。因此我们认为 在体外早期感染EBV后末梢血B细胞表现除了永生 化增殖细胞外，还存在成为静息期细胞的形式。 为证实此细胞的存在，我们利用新霉素耐性的重 组遗传基因EBV (NeoR EBV)对CD5⁺B进行感染， 加入BrdU培养了4天。然后对此细胞用EBNA2和 BrdU双重染色进行观察。可见，EBNA2阳性的细 胞中包含有BrdU阴性细胞。因BrdU和Ki67常用 于细胞增殖的标记，也就是说，虽有EB病毒的感 染，也有不能增殖的B细胞存在。我们对此细胞 加Sac、IL-2、Thiored等因子激活18 h，用BrdU 和Ki67双重染色，观察到Brdu阴性细胞中，有 Ki67阳性细胞存在。另外用EBNA2和Ki67抗体双 重染色，在EBNA2阳性细胞中，观察到Ki67阴性 细胞。这说明，感染EB病毒后不进行增殖的B细 胞，经激活可再次增生。以上结果证实了体外早 期感染EBV后末梢血B细胞后有静息B细胞存在。

现在国内外关于EB病毒及相关基因与各种 疾病关系的研究较多^[8]，但是体内环境下研究EB 病毒的感染、增殖、潜伏、激活及致病的机制 较少。关于体内储存EB病毒的静息B细胞的模型 制备，目前尚未见报道。本实验利用NeoR EBV 对CD5⁺B细胞进行感染，成功构建EBV阳性的 CD5⁺B/EBV细胞模型。此细胞EBV潜伏感染的基 因表型EBER1、EBNA2、LMP1表达为阳性，免 疫表型CD20、CD80、CD38和CD86表达增强， 表现出LCL型的EBV潜伏感染的基因表型和免疫 表型，但是LCL诱导的活性指标CD23等却没有 表达。因此，本实验建立的CD5⁺B/EBV细胞具有 LCL表型，但没有诱导出活性指标等特点，具有 机体内EBV潜伏感染静息期B细胞的一般特征^[9]， 所以期待此细胞可成为体内EBV潜伏感染研究上 的良好材料。