肺腺癌是一种死亡率很高的恶性肿瘤疾病， 具有发生早期转移的生物学特点，临床确诊时患者往往处于中晚期，约60%~80%的患者已发生纵隔 淋巴结和(或)远处转移而失去手术治疗的机会^[1]。 因此，化疗是肺腺癌治疗的重要手段，尤其是 在肺腺癌综合治疗中发挥重要作用^[2]。多西他赛 (Docetaxe1，DTX)是近年来应用于临床的一种有效 的化疗药物，其特点是以微血管为作用靶点，使其 在化疗失败的晚期或转移性肺腺癌的治疗性中极 具应用前景^[3]。然而与其他化疗药物一样，在临床 应用过程中多数患者经多西他赛化疗缓解后，即 会产生耐药性而使后续治疗效果受到严重影响。本实验以多西他赛为诱导药物，人肺腺癌细胞株 A549为诱导对象，采用逐步增加剂量、间歇体外 诱导的方法，建立稳定的人肺腺癌多西他赛耐药 细胞株，并对肺癌细胞产生多西他赛耐药性的机 制进行初步探讨，为耐药逆转研究提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 试剂

多西他赛为江苏奥赛康药业有限公司生产， RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司，新生牛血 清为杭州四季青公司产品，MTT、二甲基亚砜购 自美国Sigma公司，Bcl-2、Bax单抗及辣根过氧化 物酶标记的二抗均为美国Santa Cruz公司产品、碘 化丙啶购自美国Pharmingen公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

人肺腺癌A549细胞株由吉林医 药学院细胞室保存，培养于含10%灭活新生牛血 清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5%CO2的培 养箱中培养，0.25%胰蛋白酶液消化传代，3~4天 传代一次，并取对数生长期细胞进行实验。A549/ DTX细胞为本实验室以小剂量多西他赛逐步、间 歇诱导方式建立的耐药细胞株，稳定生长于含50 μg/L多西他赛的培养液中。 1.2.2 耐药细胞的诱导

采用逐渐增加浓度、间 歇诱导的方法建立人肺癌A549/DTX多西他赛耐药 株。首先以0.5 μg/L终浓度的DTX作用于A549细胞 24 h，换液去除死细胞之后，脱药常规培养两周， 然后将生长状态良好的A549细胞更换为新的较高 浓度的DTX进行浓度逐步递增性诱导。重复以上 诱导传代过程，直到耐药株稳定生长于DTX终浓 度达50 μg/L的培养液中并常规传代，将该耐药细 胞株命名为A549/DTX。诱导过程中，双目倒置显 微镜下观察各时段细胞的生长情况。 1.2.3 MTT法检测耐药性

将对数生长期的A549 及A549/DTX细胞调整至浓度为3×10⁵/ml后，接种 于96孔平底培养板，每孔100 μl。待细胞贴壁后 分别加入终浓度为6.25、12.5、25、50、100、200 μg/L的DTX 100 μl，每一浓度均设4个复孔，同时 设有对照孔和调零孔，各孔总体积均为200 μl， 于加药24 h后采用MTT比色法检测DTX对A549及 A549/DTX细胞生长的抑制作用。酶联免疫检测仪 在570 nm波长下测各孔的吸光度(A)值，并计算每 种浓度的多西他赛对A549及A549/DTX细胞的平均 抑制率。以药物浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘制 浓度效应曲线，确定半数抑制(IC50)浓度，并依据 公式计算A549/DTX细胞多西他赛耐药指数(RI)， 公式为RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。 1.2.4 流式细胞术测定凋亡

收获对数生长期A549 及A549/DTX细胞，接种于不同培养瓶中，细胞贴 壁后分别加入终浓度为12.5、25、50 μg/L的DTX， 并设置培养液组为对照组。24 h后收集上述各浓度 组A549及A549/DTX细胞，制备流式细胞术(FCM) 样品，测定细胞凋亡率。将细胞用PBS洗涤后调整 浓度为1×10⁶/ml，碘化丙啶染色，应用流式细胞仪 EPICS XL（美国Beckman Coulter公司）检测DNA 含量，将亚G1期峰的细胞计为凋亡细胞，并由此计 算各浓度组A549及A549/DTX细胞凋亡率。 1.2.5 蛋白质印迹分析

收获对数生长期A549及 A549/DTX细胞，加入细胞裂解液，冰浴1 h，离心 后吸取上清液，考马斯亮蓝定量检测各组胞质总蛋 白。检测后，将样品调成相同浓度。经SDS-PAGE 电泳后转移至醋酸纤维薄膜，牛血清蛋白37℃封闭 2 h，分别加入Bax、Bcl-2鼠抗人单克隆抗体，4℃ 过夜，再加入HRP标记的二抗37℃放置2 h，DAB显 色试剂盒显色，拍照记录。以β-actin为内参照，采 用凝胶成像系统测定各条带积分吸光度值。 1.3 统计学方法

实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS 11.0软件进行相关统计学分析。数据中组间的 比较采用方差分析，两两比较采用q检验。检验水 准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 MTT法检测细胞耐药特性结果

多西他赛对A549及A549/DTX细胞均具有明显的 生长抑制作用，表现为低浓度抑制细胞能力较小，随 着浓度的增加对细胞的抑制率呈上升趋势，在测定浓 度范围内具有明显的剂量依赖性，见图 1。根据浓度效 应曲线，确定DTX作用24 h后A549及A549/DTX的IC50 分别为14.9和275.7 μg/L，耐药指数RI为18.5，与亲本 细胞A549相比，A549/DTX表现出较高的耐药性。

图 1 不同浓度多西他赛对A549、A549/DTX细胞的生长抑 制作用 Figure 1 Inhibitory effect of different concentrations of DTX on A549 and A549/DTX cells

光学显微镜下A549细胞均贴壁生长，呈长梭形或 多角形，排列较为均匀紧密。耐药诱导过程中，细胞形 态会发生一些改变。加入DTX 24 h后，细胞胞体变圆 变小，敏感细胞不断死亡，需数次换液不断清除死细 胞，最后仅存少数贴壁细胞。存活细胞的胞体变大， 胞内空泡增多，并且细胞生长变缓慢，会出现一些崩 解死亡的细胞。撤药14 d左右时，存活下来的细胞可恢 复成团生长。诱导建立的A549/DTX细胞与A549细胞形 态并无明显差别，仅表现为胞体积略增大，细胞边界 模糊，呈较大的菱形和三角形，细胞排列较为松散，见 图 2。

图 2 光学显微镜观察A549、A549/DTX细胞形态 Figure 2 Cell morphological observation of A549 and A549/DTX under microscope

终浓度为12.5、25、50 μg/L的DTX作用24 h后，收 集各浓度组A549及A549/DTX细胞，流式细胞术测定凋亡率。与A549细胞相比，A549/DTX细胞的自然凋亡率 升高，并且差异具有统计学意义(P＜0.05）。与不同浓 度多西他赛作用24 h后，A549及A549/DTX细胞凋亡率 在测定浓度范围内均随多西他赛浓度升高相应增加。但 是对于同一浓度的多西他赛，A549/DTX细胞的凋亡率 均明显低于A549细胞，两者相比差异有统计学意义(P＜0.01），见表1。

表1(Table 1)

表1 多西他赛对A549及A549/DTX细胞凋亡影响的比较(%) Table 1 Comparison of the effect of docetaxel on apoptosis of A549 and A549/DTX (%)

表1 多西他赛对A549及A549/DTX细胞凋亡影响的比较(%) Table 1 Comparison of the effect of docetaxel on apoptosis of A549 and A549/DTX (%)

两种细胞株均出现Bax、Bcl-2蛋白阳性条带。 其中Bcl-2蛋白条带在建立的A549/DTX细胞株比在 A549细胞株中深、宽；而Bax蛋白在A549/DTX细胞 株中蛋白条带较A549细胞变浅、变细。并且A549及 A549/DTX细胞Bcl-2蛋白表达量均随药物浓度升高而 降低，Bax蛋白表达量随浓度升高而增加，见图 3。以 β-actin作为内参照，采用图像分析系统对条带进行定 量分析，进一步证实：A549/DTX细胞Bcl-2蛋白表达 增加，Bax蛋白表达减少，且均与A549细胞有明显差 异(P<0.01），见图 4。

图 3 Western blot分析Bax、Bcl-2蛋白表达 Figure 3 Bax,Bcl-2 protein expression analyzed by Western blot

图 4 Western blot定量检测分析Bax、Bcl-2蛋白表达 Figure 4 Bax,Bcl-2 protein expression analyzed quantitatively by Western blot

多西他赛是肺癌尤其是肺腺癌治疗的重要一线和二线用药，然而化疗药物普遍存在的耐药现 象限制了此类药物的疗效和更广泛的临床应用， 所以肿瘤耐药机制研究及耐药逆转，已成为肿瘤 研究领域的一大热点。耐药及逆转研究，通常采 用体外药物诱导的方法建立耐药细胞模型。在长 期诱导过程中，敏感细胞被化疗药物杀死，残留 下来的细胞得以扩增，这些细胞在形态和生物学 行为上可能发生某些改变，成为耐药细胞株。本 研究通过小剂量多西他赛逐步、间歇诱导方式建 成A549/DTX细胞株，对多西他赛明显耐药。与亲 本细胞A549相比，A549/DTX细胞多西他赛的耐 药指数达到18.5，并且能稳定生长传代，表明建立 A549/DTX细胞株可进一步用于多西他赛耐药细胞 的相关研究。

诱导凋亡是化疗药物抗肿瘤的作用机制之一。 多西他赛能够阻碍肿瘤细胞有丝分裂中期向后期 转化，使细胞周期阻滞于G2/M 期，以及能够提高 线粒体膜通透性，引起促凋亡活性物质释放，导 致肿瘤细胞凋亡，发挥抗瘤作用^[4]。本研究将多西 他赛分别作用于A549细胞及A549/DTX细胞，流式 结果显示两种细胞株的凋亡率均随药物浓度的升 高而增加，但对于同一浓度多西他赛，A549/DTX细胞的凋亡率均明显低于A549细胞(P＜0.01）。 该结果表明诱导凋亡是多西他赛抑制肺腺癌细胞 增殖的作用机制之一，更为重要的是提示凋亡抵 抗可能与A549/DTX细胞株耐药产生密切相关。

相关实验及临床研究表明，凋亡抵抗是肿瘤细 胞对化疗药物产生耐药性的重要机制，抗凋亡基 因bcl-2异常表达是耐药形成的因素之一^[5]。bax基 因是bcl-2基因家族中成员，拮抗bcl-2的抗凋亡效 应，促进细胞凋亡。bcl-2和bax是位于同一基因家 族中，作用机制不同的一对基因，它们表达的变 化，尤其是两者比值的变化可影响化疗药物的效 果，在临床耐药形成过程中扮演了重要的角色。 体内、体外研究实验中均有证实：bcl-2表达增高 或bax表达降低，与多种肿瘤细胞的耐药性密切相 关^[6]。在bcl-2对人小细胞肺癌细胞H446/DDP多药 耐药性影响的研究中，通过真核转染下调肺癌细 胞bcl-2基因的表达，能增强H446/DDP对顺铂的敏 感度，促进顺铂诱导的凋亡^[7]。 同样在非小细胞肺 癌细胞的小鼠移植瘤实验中，将长春瑞滨与bcl-2 反义核苷酸联合作用植瘤小鼠后，对肿瘤的抑制 作用明显强于单独使用长春瑞滨^[8]。与bcl-2作用 相反，bax表达降低可使药物诱导的细胞凋亡受到 不同程度的抑制，进而导致肿瘤细胞产生耐药。 所以，检测肿瘤细胞或肿瘤组织中bcl-2和bax的表 达对于耐药机制研究具有重要的意义，已成为该 领域关注的热点。bcl-2和bax基因产物Bcl-2蛋白和 Bax蛋白分别是Bcl-2家族中的抗凋亡和促凋亡蛋 白^[9]。Bax结合于线粒体膜上，使线粒体跨膜电位 下降，促进细胞色素c释放，从而激活凋亡通路； Bcl-2主要通过与Bax形成异二聚体及抑制Bax向线 粒体的移位，阻碍Bax的功能。Bcl-2表达下调可以 导致细胞凋亡，Bcl-2高表达可抑制细胞凋亡，且 Bcl-2/Bax 比值决定了细胞对凋亡的敏感度^[10]。

为明确A549/DTX细胞抗凋亡现象的分子机 制，我们对两种细胞株的凋亡调控因子Bcl-2和Bax 的表达进行了检测。经Western blot分析发现，Bcl-2 蛋白在多西他赛耐药细胞株A549/DTX中的表达， 较亲本A549细胞明显升高，而Bax蛋白表达明显降 低，说明在诱导建立A549/DTX细胞的过程中，肿 瘤细胞可能通过上调Bcl-2表达及下调Bax表达，抵 抗化疗药物形成耐药。为进一步验证结论，将两种 细胞株分别与不同浓度多西他赛作用，结果发现 A549/DTX细胞株中存在Bcl-2蛋白表达增加及Bax 蛋白表达减少，均与亲本A549细胞有明显差异，进 一步表明耐药肿瘤细胞株通过启动bcl-2基因及下调 bax基因，阻断细胞凋亡通路，抑制药物诱导的细 胞凋亡，降低细胞对化疗药物的敏感度。

本研究建立肺腺癌多西他赛耐药细胞株A549/ DTX，并初步阐明Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白的表 达可能参与其耐药机制，从抗凋亡的角度解释耐 药现象，这不同于经典的耐药机制，为研究细胞 耐药提供了一个新思路。已有实验证明将敏感细 胞与耐药细胞进行mRNA差异筛选，筛选出bcl-2 基因，并将bcl-2称为“耐药基因”^[11]。可见，Bcl-2 作为凋亡抑制蛋白在肿瘤细胞耐药中也起着不可 低估的作用。因此我们考虑在多西他赛耐药逆转 研究中，Bcl-2是否可作为耐药逆转靶分子？总 之，伴随研究的逐步深入，必将有助于提高和改 善多西他赛的临床疗效，为延长肺腺癌患者生存 期、提高生存质量提供有效的手段。