肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人类健 康和生命威胁最大的恶性肿瘤。目前，由于其具 体发病机制不十分清楚，以手术、化疗、放疗为 主的综合治疗手段不能达到理想效果，肺癌的预 后仍较差^[1]。因此，探讨肺癌的发病机制，找到治 疗药物的靶位点十分迫切。

细胞凋亡是由于细胞内外环境变化或死亡信 号激发以及在基因调控下所引起细胞主动死亡的 过程，其发生原因和途径复杂多样，许多基因参 与细胞凋亡的基因调控，包括致死基因和存活基 因。其中Bcl-2家族成员在细胞凋亡的基因调控过 程中起着至关重要的作用。Bcl-2家族可以分为两 类：一类是抗细胞凋亡基因，代表基因是Bcl-2基 因；另一类是促细胞凋亡基因，代表基因是BAX 基因，他们通过激活一系列下游基因发挥调节凋 亡作用。本研究旨在探讨BAX基因转染对肺癌 A549细胞的凋亡及化疗敏感度的影响，为提高肺 癌的化学治疗效果、补充手术和放疗的不足奠定 理论基础。1 材料与方法 1.1 细胞系及培养条件

人肺癌A549细胞系购自中科院上海细胞库。 A549细胞株在含10%胎牛血清的DMEM培养液 中，于37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养。细胞呈贴壁生长，接种细胞24 h进入对数生长期后开 始后续实验。1.2 主要试剂

顺铂（Cisplatin，DDP）购自山东齐鲁 制药厂，碘化丙啶(PI）和AnnexinV-FITC购 自美国Sigma公司。总RNA抽提试剂TRIzol和 Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen 公司。RT-PCR试剂盒为日本TaKaRa公司产品。 pcDNA3.1-BAX表达质粒由英国玛丽皇后学院惠 赠。1.3 Cell counting kit 8(CCK8)法检测DDP对A549细胞增殖的影响

CCK-8是基于WST8的广泛应用于细胞增殖 和细胞毒性的快速高敏感度检测方法，WST8是 MTT的一种升级替代产品，比MTT的结果更加稳 定，并且其线性范围更宽，敏感度更高。本研究 以每孔1×10⁴细胞接种于96孔培养板中，培养24h 后，分别加入含不同浓度DDP的DMEM培养液， 使DDP的终浓度为0.5、1、2、4、8和16 μg/ml。 同时设阴性对照组和空白对照组，阴性对照组不 加顺铂只加培养液，空白对照组不加细胞只加培 养液。每组3个复孔，培养48h后，每孔加入20 μl CCK-8溶液，在培养箱内继续孵育1.5 h后用酶标 仪检测吸光度值，检测波长为450 nm，测量每孔 吸光度值。细胞增殖抑制率（%）=[1-（OD_实验组- OD_{空白对照组}）/（OD_{阴性对照组}-OD_{空白对照组}）] ×100%。1.4 细胞转染

以每孔5×10⁶个细胞将对数生长期的肺癌细胞 A549转种于6孔培养板中，37℃、5%CO2环境中 培养24 h，细胞长至80%融合。实验分为三组： 空白对照组，pcDNA3.1空载体组和A549/BAX 转染组。转染前3~4 h换2 ml无血清DMEM培养 液培养。在无菌1.5 ml试管中制备下述溶液：溶 液A：将5 μl pcDNA3.1-BAX质粒溶于250 μl无血 清DMEM培养液中，轻微摇晃混匀5 min；溶液 B：将10 μl Lipofectamine 2000移至250 μl无血清 DMEM培养液中，轻微摇晃混匀5 min；溶液C: 合并溶液A和溶液B，轻轻混匀，室温下孵育20 min。弃去细胞培养液，用无血清DMEM培养液 洗涤细胞两次，备转染用。将溶液C加入含肺癌 细胞的六孔板中，前后轻微摇晃培养板，同时用 pcDNA3.1空质粒做阴性对照。37 ℃、5% CO2环境 中培养5~6 h后，更换为10%胎牛血清的DMEM培 养液继续培养，然后换用含G418的培养液进行筛 选，2周后从稳定表达的细胞克隆中挑选出多个单 克隆继续培养，将pcDNA3.1和BAX-pcDNA3.1转 染的细胞分别命名为A549/pcDNA3.1和A549/BAX， 并通过RT-PCR检测BAX基因的mRNA表达水平。1.5 半定量RT-PCR法检测转染结果

采用TRIzol试剂按照说明书操作提取总 RNA。通过甲醛聚丙烯酰胺凝胶电泳检测RNA 质量，通过检测OD_260nm/280nm计算RNA浓度。以 1 μg总RNA为模板通过反转录系统合成cDNA 第一链。应用Primer5.0设计BAX引物，上游引 物：5′-CTGAGCAGATCATGAAGACA-3′,下游 引物：5′-AAAGATGGTCACGGTCTG-3′，扩增 长度为482 bp。β-actin为内参照，上游引物为： 5′-CACCAACTGGGACGACAT-3′，下游引物为： 5′-ACAGCCTGGATAGCAACG-3′，扩增长度为189 bp。PCR反应条件为：95 ℃4 min后，95℃45 s，59℃ 45 s，72℃60 s，共32个循环，再72℃延伸7 min。 RT-PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。采 用Fluor-S MultiImager（Bio-Rad公司，California， USA）系统成像并通过Multi-Analyst（Bio-Rad公 司,California，USA）软件进行灰度值分析。数据 经β-actin进行校正后加以分析。1.6 细胞周期分析

常规胰酶消化并收集细胞（1 000 r/min， 4℃，离心5 min），PBS漂洗3次，每次5 min， 冰乙醇固定，400 μl 0.05 g/L碘化丙啶(PI）室温 避光染色30 min后进行流式细胞仪（FACScan， Becton Dickinson）检测，采用Cell Quest软件对 细胞周期进行分析。以增殖指数(Proliferation index，PI）表示A549细胞的增殖水平， PI(%)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G1)100%。1.7 细胞凋亡分析

将A549、A549/pcDNA3.1和A549/BAX细胞按 每孔1×10⁶细胞接种于24孔培养板过夜培养，第2 天加入4 μg/ml DDP常规培养72 h，按说明书加入 FITC和PI双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。1.8 统计学方法

通过SPSS 13.0对数据进行分析，结果采用均 数±标准差（x±s）表示，多样本均数差别的多重 比较采用单因素方差分析，SNK-q检验，P<0.05为 具有统计学意义。2 结果 2.1 CCK8法筛选合适的DDP作用浓度

不同浓度DDP作用A549细胞48 h后，各实验组 DDP对A549细胞的均有抑制作用。随着药物浓度 增高抑制率显著提高，其中4 μg/ml组的抑制率近 似于50%，后续实验浓度将采用4 μg/ml，见表1 。

表1(Table 1)

表1 不同浓度DDP作用A549细胞后CCK8结果 Table 1 CCK8 results after A549 cells treated with different concentrations of DDPa

表1 不同浓度DDP作用A549细胞后CCK8结果 Table 1 CCK8 results after A549 cells treated with different concentrations of DDPa

RT-PCR检测结果显示，A549/BAX表达质粒 转染组BAX基因的表达较空白对照组和pcDNA3.1 空载体组明显上调，见图 1。

图 1 BAX基因转染效果的检测 Figure 1 Transfection effect on BAX detected by RT-PCR

细胞经PI染色后通过流式细胞术检测细胞 周期，结果显示：A549+DDP组、A549/BAX和 A549/BAX+DDP组细胞增殖指数(PI）明显降 低，分别为32.49%、29.75%和29.42%。A549和 A549/pcDNA3.1组S期细胞百分比分别为33.23%和 31.35%，而A549+DDP 组（18.71%）、A549/BAX 组（12.18%）和A549/BAX+DDP组（13.13%）， 与A549和A549/pcDNA3.1两组比较均有所减少， 差异有统计学意义(P<0.05）。转染BAX组及 DDP联合BAX转染组G1期细胞明显增加，由对照 组的51.70%增加到71.25%和70.58%，提示细胞发 生G1期阻滞。该研究结果表明BAX基因和DDP均 可以明显降低细胞增殖率，同时转染BAX基因联 合DDP可以进一步抑制细胞的增殖，见表2 。

表2(Table 2)

表2 过表达BAX和DDP处理后A549细胞周期分析(x±s,%,n=3) Table 2 A549 cell cycle profiles with BAX overexpression and 4 μg/mL DDP treatment (x±s,%,n=3)

表 2 过表达BAX和DDP处理后A549细胞周期分析(x±s,%,n=3) Table 2 A549 cell cycle profiles with BAX overexpression and 4 μg/mL DDP treatment (x±s,%,n=3)

与A549组相比，A549/BAX组A549细胞系凋 亡率明显增高，细胞凋亡率由A549组的1.87%、 A549/pcDNA3.1组2.26%、A549/BAX组的7.73%和 A549+DDP组的10.43%增加到A549/BAX+DDP组 的21.14%，差异有统计学意义(P<0.05）。该研 究结果表明转染BAX基因和DDP均可以明显增加 A549细胞的凋亡率，同时转染BAX基因联合DDP 可以进一步增加A549的凋亡率，见图 2。

图 2 BAX基因转染效果的检测 Figure 2 Transfection effect on BAX detected by RT-PCR

细胞凋亡是基因控制的细胞死亡，参与胚胎 发育、神经系统完善和免疫系统调节等多种生理 过程，多种疾病的发生和凋亡异常有关^[2]。细胞凋 亡的重要途径之一是Bcl-2家族蛋白-线粒体途径， Bcl-2基因家族的表达和调控在细胞凋亡信号转导 途径中发挥重要作用^[3]。该基因家族通过这个复杂 的调控网络控制细胞凋亡以及肿瘤细胞对化疗药 物的敏感度^[4]。在Bcl-2基因家族中包括抑制凋亡 的成员如Bcl-2和Bcl-X等，还有促进凋亡的成员如 BAX和BAK等。Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抑凋亡 蛋白的比例是决定细胞凋亡发生与否和凋亡作用 强弱的关键因素。促凋亡蛋白在细胞中的比例还 决定细胞对死亡信号的反应及细胞的命运。有研 究表明，BAX表达降低与肿瘤细胞对化疗的敏感 度差和肿瘤患者生存期短有关^[5]。BAX与Bcl-2比 例可以作为预测口腔鳞癌预后的生物标记。BAX 基因在胃癌^[6]、肝癌^[7]等肿瘤组织中表达明显下 调。BAX基因突变与转移的乳腺癌化疗疗效降低 和生存期缩短相关^[8]。

顺铂是治疗肺癌最常用的化疗药物之一。该 药物为金属铂类络合物，具有广谱抗瘤、对厌氧 细胞有效的特点。在细胞内，DDP先将分子中的 氯解力，然后与DNA上的鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧 啶形成交叉联结，也可形成双链间的交叉联结，从而抑制DNA复制过程。同时损伤细胞膜上结 构，肿瘤细胞由于增值较快，对DDP的细胞毒作 用较正常细胞更为敏感，但长期使用会产生很大 不良反应，严重影响患者的生存质量。在本实验 中采用CCK8法检测各浓度DDP对肺癌A549细胞 的增殖抑制率，其中4 μg/ml最接近半数抑制量。 流式细胞仪检测结果提示DDP作用于细胞G1期和 S期，使细胞产生G1周期阻滞，并能使细胞凋亡， 从而导致细胞增殖减慢。在肺癌A549细胞中转染 BAX基因后，BAX表达增高，细胞凋亡比例增 加，证明高表达BAX可以诱发细胞凋亡，A549细 胞中G1期增多，S期细胞减少，提示肺癌细胞在进 入有丝分裂前不能进行DNA合成，使完成有丝分 裂过程的肿瘤细胞不断减少，进而使肿瘤细胞的 增殖受到抑制。而且与DDP联合应用后还能继续 增加细胞凋亡的比例，说明细胞中促凋亡蛋白在 与抑凋亡蛋白的比例中占优势，导致线粒体对各 种刺激的抵抗能力下降，从而使细胞色素C更容 易释放而导致后续凋亡级联反应^[9]。最终体现为 A549细胞对DDP化疗敏感性增高。当然，本研究 中仅检测了DDP处理A549细胞48小时后的细胞生 长曲线，不能完全说明细胞的生长特性，当药物 浓度或细胞浓度改变是否仍然能达到增加化疗敏 感度的作用需要更多地后续实验验证。

BAX 高表达可增加肿瘤对化疗药物如吉西他 滨、5-Fu 以及放射治疗的敏感度，提高其基因表 达、上调BAX活性等针对BAX 的靶向治疗已显示 出促进白血病细胞凋亡、增强药物抗癌效应的作 用^[10]。此外BAX作为一个重要的促凋亡因子，已 成为研究及评价各种抗癌药物作用机制与疗效的 标准之一。当然还有很多问题需要进一步研究， 如BAX在肺癌中高表达的机制，BAX与肺癌侵袭 转移的关系等等。深入研究BAX与肺癌之间的关 系，有助于肺癌的临床诊断、提高治疗效果和判 断预后。