近年来，有学者研究发现肿瘤相关蛋白 (tetraspanin 1,TSPAN1)在人胰腺癌组织中高表达， 提示TSPAN1的异常表达与胰腺癌的发生、发展 密切相关^[1]，但是，到目前为止，尚没有直接证 据支持这个观点，且胰腺癌组织中TSPAN1蛋白 表达的作用研究国内尚未见报道。为进一步研究 TSPAN1表达在胰腺癌中的作用，本实验首先检测 了TSPAN1的基因和蛋白在人胰腺癌组织与胰腺癌 细胞株中的表达，然后构建TSPAN1干扰RNA表达 载体，经病毒介导转染人高侵袭性的胰腺癌细胞 Bxpc-3，从肿瘤细胞中TSPAN1的表达以及细胞体 外生长增殖能力的变化评价TSPAN1干扰RNA抗胰 腺癌细胞增殖的作用。 1 资料与方法 1.1 资料

收集2009年2月—2011年10月期间在陕西渭南 市中心医院经手术治疗并均经病理证实的人胰腺 癌组织标本，共计12例，设为胰腺癌组；癌旁组 织取自距癌组织边缘0.5 cm区域，切缘经病理证 实未见癌细胞浸润，癌旁正常胰腺组织设为对照 组。12例胰腺癌患者，其中男7例，女5例，均为 第1次手术，平均年龄49岁(21~68岁)，术前均未接 受任何放疗化疗等抗肿瘤治疗；TNM 分期(1997 年恶性肿瘤国际临床病期分类)：Ⅰ期2例、Ⅱ期4 例、Ⅲ期3例、Ⅳ期3例。各组标本于切除后各取 120 mg，均分成两份，在液氮中冻存备用，分别 用于RT-PCR及免疫印迹分析。其中，TNM 分期为 Ⅳ期的切除标本每例多取一份用于免疫组织化学 检测。

人胰腺癌细胞株Bxpc-3购自上海细胞生物研 究所，细胞培养用DMEM (Dulbecco s' modified eagle medium)、新生牛血清和胰蛋白酶均为Gibco 公司产品；鼠抗人TSPAN1(B-9)：sc-376551为 Santa Cruz公司产品，PV9000试剂盒购自北京中杉 金桥有限公司，DAB显色试剂盒购自迈新生物技 术公司，TRIZOL(Invitrogen)购于诺贝生物技术有 限公司，总RNA用反转录试剂盒(Fermentas)由上 海晶美公司提供；鼠抗人GAPDH多克隆抗体、兔 抗鼠IgG、蛋白裂解液、ECL化学发光显色液均购 于碧云天生物技术公司；辣根过氧化物酶(HRP)标 记的兔抗鼠IgG购自诺贝生物技术有限公司(Pierce Biotechnology，美国)；干扰RNA购自上海吉凯基 因技术有限公司，慢病毒载体pSuper-retro购自上 海杰美基因技术有限公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

人胰腺癌细胞株Bxpc-3 培养选用含有10%新 生牛血清的DMEM，置37℃、100%湿度和5% CO2 培养箱内培养。待胰腺癌Bxpc-3细胞长满培养瓶 底部70%~80%时，消化传代，取对数生长期细胞 用于实验。 1.2.2 免疫印迹法检测胰腺癌中TSPAN1蛋白的表达

在培养第3天用蛋白裂解液0.25%的胰酶消化 Bxpc-3细胞，提取蛋白；收集自患者的胰腺癌及 癌旁组织解冻后置于裂解液中匀浆，常规提取蛋 白、SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并将蛋白电 转到NC上，一抗(TSPAN1，效价1:600)，4℃孵育 过夜；兔抗鼠IgG(1:2 000)孵育，室温下振摇1 h， ECL试剂盒进行免疫显色，化学发光凝胶成像系 统中曝光，照相。洗脱蛋白，再次按以上步骤进 行检测(一抗为GAPDH，效价1:1 000；二抗为兔 抗鼠，IgG效价1:2 000)。Bio-Rad凝胶成像系统及 软件分析结果，将阳性条带的密度与GAPDH条带 密度的比值作为TSPAN1 蛋白的相对表达量。 1.2.3 免疫组织化学法检测胰腺癌中TSPAN1蛋白的表达

取手术切除的胰腺癌组织，30 μm 冰冻切片， 0.1 mol/L PBS 洗涤5 min × 3次；3%的过氧化氢室温避光孵育30 min，PBS液洗5 min× 3次；2 ml/L正 常羊血清封闭，37 ℃温箱湿盒内孵育20 min；用 滤纸吸干后，一抗1:400 TSPAN1孵育，4℃过夜。 用PBS代替一抗作阴性对照。0.1 mol/ L PBS 液洗5 min × 3次；PVI 37℃孵育30 min，加PV Ⅱ，37℃ 孵育30 min；DAB 室温下避光显色；苏木精对比 染色，常规脱水，透明，封片。电脑图像采图软 件获取免疫组织化学图像。 1.2.4 RT-PCR检测胰腺癌TSPAN1基因的表达

在第1、3天用0.25%的胰酶消化细胞， 提取RNA。胰腺癌及癌旁组织采用TRIZOL 提取RNA，取2μm总RNA用反转录试剂盒 (Fermentas)转录成cDNA，进行RT-PCR 反 应。扩增用到的引物序列，TSPAN1：上游 引物5'-TGGGCTGCTATGGTGCTA-3'；下 游引物5'-TGCAGGTTTCATTGGCTGT-3'； 引物扩增片段为345bp；GAPDH：上游引物 5'-AGGCTGTGGGCAAGGTCA-3' ；下游引物5'-C GTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3'，引物扩增片段 为246 bp。PCR 反应条件为(1) TSPAN1：94℃ 预 热4 min，94℃55 s，56℃50 s，72℃90 s，30 个 循环，72℃10 min，4℃ 保存。(2) GAPDH：94℃ 预热3 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30 个 循环，72℃10 min，4℃ 保存。扩增产物用1%琼 脂糖凝胶电泳分析，溴化乙锭染色后，Bio-Rad凝 胶成像系统及Labworks软件进行检测和灰度强度 分析，将阳性条带的密度与GAPDH条带密度的比 值作为TSPAN1 mRNA 的相对表达量。 1.2.5 TSPAN1-siRNA的设计合成

根据Neuclpeptide中TSPAN1的编码序列， 按照RNA干扰序列设计原则，利用在线软件设 计(http://RNAiDesigner.invitrogen.com)并合成靶 向沉默TSPAN1的干扰RNA(siRNA)序列5'-CC TCAGCAGTTCCCTCTTT-3'，5'-GCCTTGGT- GTACACCACAA-3'，5'-GCCTGCCATCAAGAA AGAT-3'，5'-CCT-GCCATCAAG- AAAGATT-3'， 将选出的序列应用Blast在EST 数据库查询，确认 与其他基因无同源序列。将其克隆至慢病毒载体 pSuper-retro，构建编码TSPAN1 siRNA 的病毒载体 pSuper-retro-TSPAN1。 1.2.6 TSPAN1-siRNA的细胞转染

人胰腺癌细胞株Bxpc-3常规培养，待细胞长满 培养瓶瓶底70%时用2.5 g/L Trypsin-EDTA 消化细胞 传代。按照说明书方法将慢病毒载体转染BxPC-3 细胞。转染48 h后细胞按1∶4传代，将实验分为空 白对照、阴性对照、转染组共3组，其中空白对照 是未转染质粒的Bxpc-3；阴性对照是转染pSuperretro-GFP载体的BxPC-3，即为空载体组；转染组 为转染pSuper-retro-TSPAN1干扰载体的BxPC-3。转 染48 h 后观察细胞无明显异常后进行后续实验。 1.2.7 MTT (噻唑盐比色法) 检测细胞增殖

取1 000个细胞干扰48 h 后每孔加入20 μl MTT 溶液(5 g/L，即0.5% MTT)，继续培养4 h。终止 培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，使结晶物充分溶解。在490 nm处测量各 孔的A 值，分别以转染时间、A 值为横、纵坐标， 绘制细胞生长曲线。 1.2.8 检测干扰后TSPAN1的表达

接种48 h 后，待细胞完全贴壁并呈指数生长 时，收集各组细胞行RT-PCR和Western blot检测 TSPAN1的表达，具体步骤如前述。 1.3 统计学方法

计量数据以均数±标准差表示，统计分析采用 SPSS13.0 软件来处理。组间比较采用方差分析， 以P< 0. 05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 TSPAN1在手术标本及胰腺癌细胞株的表达

RT-PCR所得的TSPAN1的基因片段长度为345 bp，与预期目的片段分子质量的大小完全相等。 作为对照的胰腺癌旁组织中检测到少量TSPAN1的 RNA表达(0.31±0.01)，而在胰腺癌组织及胰腺癌 细胞株TSPAN1 mRNA 的表达分别为(0.63±0.01)、 (0.58±0.09)，高于对照组TSPAN1 mRNA的表达 (0.18±0.01)，两组组间比较，差异有统计学意义 (P<0.01)，扩增产物电泳结果，见图 1 。

图 1TSPAN1基因在手术标本及胰腺癌细胞株的表达 Figure 1TSPAN1 gene expressions in human pancreatic cancer tissues and Bxpc-3 cells

Western blot在各胰腺癌组中检测到TSPAN1蛋 白的表达，相对分子量为26 kD，对照组胰腺癌旁 组织中检测到TSPAN1的蛋白表达为(0.18±0.01)， 而在胰腺癌组织及胰腺癌细胞株TSPAN1蛋白的表 达分别为(0.54±0.01)、(0.48±0.02)，高于对照组中 TSPAN1的表达，两组组间比较，差异有统计学意 义(P<0.01)，见图 2 。

图 2 TSPAN1蛋白在手术标本及胰腺癌细胞株的表达 Figure 2 TSPAN1 protein levels in human pancreatic cancer tissues and Bxpc-3 cells

免疫组织化学染色显示，在癌旁组织中可以 检测到少量的TSPAN1阳性染色细胞，见图 3 A，主 要在胰腺癌组织中表达，着色部位为细胞膜和细 胞质，胞核不着色，见图 3B。

图 3 TSPAN1蛋白在癌旁组织及胰腺癌组织中的免疫组织化学染色( ×400) Figure 3 Immunohistochemistry positive stains of TSPAN1 in human pancreatic cancer adjacent tissues and pancreatic cancer tissues( ×400)

转染后Bxpc-3 细胞在对数生长期(12~36h) 的 活力受到明显抑制，且在36~72 h之间转染细胞的 增殖仍然被抑制，见图 4。提示在转染后细胞增殖 能力减弱。

图 4 干扰TSPAN1表达对细胞活力的影响 Figure 4Effects of TSPAN1-siRNA on Bxpc-3 cells

TSPAN1-siRNA转染抑制胰腺癌细胞中 TSPAN1蛋白的表达转染48 h后，RT-PCR检测发现 TSPAN1基因在空白组、阴性对照组和转染组细胞 中均检测到目的条带，在空白组、对照组细胞的TSPAN1 mRNA表达量(0.84±0.11；0.79±0.12) 高于 转染组(0.41±0.03)，差异有统计学意义(P=0. 016或 P=0. 0002) ，见图 5。

图 5siRNA转染后TSPAN1基因在各组的表达 Figure 5 TSPAN1 gene expressions in human pancreatic cancer tissues and Bxpc-3 cells after administration with TSPAN1-siRNA

Western blot检测TSPAN1蛋白表达，发现空白 组、阴性对照组和转染组细胞中均有相对分子质 量约26 kD的TSPAN1蛋白表达，但空白组、对照 组细胞的TSPAN1蛋白表达量较高(0.57±0.06；0.55 ±0.01)，而在转染组细胞表达量较低(0.32±0.05)， 差异有统计学意义(P=0.024或P=0.004)，见图 6。上述结果表明，转染48 h后，转染组的胰腺癌细胞 中TSPAN1蛋白表达受到抑制。

图 6 siRNA转染后TSPAN1蛋白在各组的表达 Figure 6 TSPAN1 protein expressions in human pancreatic cancer tissues and Bxpc-3 cells after treatment with TSPAN1-siRNA

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其 恶性程度高、发病隐匿、病情进展快、预后极 差，近年来其发病率明显增高^[2]，但是，其远期疗 效和预后并未有突破性进展。明确其发病机制， 针对特定发病环节进行有效干预从而提高疗效已成为研究的热点。 近年来的研究发现，胰腺癌从蛋白质组学的 角度可被认为是一种蛋白质缺陷病，其发生过程 中有多种蛋白会发生异常变化，这种变化包括蛋 白表达量的增加或减少以及蛋白翻译后加工上的 改变^[3]；研究发现，与正常组织相比，胰腺癌组织 中存在多种表达异常的蛋白，其中就包括肿瘤相 关蛋白TSPAN1^[1]。

TSPAN1是四跨膜蛋白超家族新成员，其在 多种肿瘤组织中存在过表达，可能通过转导细胞 分裂信号和引起细胞异向分化或去分化、引起癌 细胞增殖与血管生成等机制，参与癌变和侵袭 转移过程^[2]。有实验研究表明与正常组织相比， TSPAN1在胰腺癌组织中呈现高水平的表达^[1]，但 是目前为止，未见TSPAN1在胰腺癌中具体作用 的相关文献报道。研究表明^{[4, 5]}在宫颈癌及结直肠 癌、肝癌等多种肿瘤组织中均有TSPAN1的过表 达。钱铮等^[6]研究发现胃癌组织中TSPAN1呈现高 表达，且与胃癌病理分级、临床分期及预后密切 相关，推测TSPAN1与癌细胞增殖有关。本研究 发现，在胰腺癌组织与胰腺癌细胞株Bxpc-3中均 检测到了高水平表达（包括基因及蛋白表达）的 TSPAN1，且免疫组织化学染色结果显示TSPAN1 定位于肿瘤细胞的细胞质内，提示TSPAN1的异常 表达可能在胰腺癌的发生发展中起到了一定的作 用。为了证实这一推论，接下来，我们通过RNA干 扰技术转染TSPAN1小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)入胰腺癌Bxpc-3细胞中^{[7, 8, 9, 10]}，并观察 对其细胞恶性生物学行为的影响，结果发现，与 空载体组相比，有效干扰TSPAN1表达后，肿瘤 细胞的活力减弱，增殖能力减弱了。这些结果证 明，干扰TSPAN1的表达抑制了胰腺癌细胞的增 殖，提示沉默TSPAN1 确实能够降低肿瘤细胞恶性 生物学行为。细胞的异常增殖及分化是导致肿瘤 形成的重要原因。因此，我们推测TSPAN1作为细 胞表面蛋白可能通过连接分子内部或者与其他表 面蛋白相互作用，形成跨膜蛋白网络，参与转导 细胞分裂的信号、调控细胞增殖和分化、促进血 管的生成和细胞黏附移行等，从而参与了癌变和 侵袭转移过程。

综上，本研究结果表明TSPAN1在胰腺癌中 的异常过度表达可能与胰腺癌的发生发展相关， 而针对TSPAN1的siRNA能有效抑制体外胰腺癌细 胞中TSPAN1的表达，并抑制细胞增殖，因此， TSPAN1可望作为胰腺癌基因治疗的靶点，本研究 无疑为临床治疗胰腺癌提供了有价值的前期研究 基础，为胰腺癌的治疗开辟了新的途径。