乳腺癌是当今全球女性发病率位居第一的恶 性肿瘤，约占女性恶性肿瘤的23%^[1]。乳腺癌的发 生发展是环境与遗传两因素共同作用的结果，其 中CpG岛启动子甲基化所致的抑癌基因失活被认 为是主要途径之一^[2]。近年来大量的研究表明，视 黄醇受体β（retinoic acid receptor β,RARβ）基因作 用于恶性肿瘤细胞系的反转录过程，抑制肿瘤细 胞的增殖；如果失去了RARβ基因的调节作用就会 诱发恶性肿瘤的发生^[3]。因此，RARβ作为乳腺癌 抑制因子备受关注，其甲基化与乳腺癌的发生发 展具有重大的关系^[4]。然而，多数研究存在样本量 小或随访资料不全的缺点。本研究拟检测192例乳 腺癌组织中RARβ基因甲基化情况，结合临床病理 及随访资料，探讨RARβ基因甲基化与乳腺癌临床 病理参数及预后的关系。 1 资料与方法 1.1 资料

收集澳大利亚查尔斯爵士盖尔德纳医院手术 并病理确诊的未经化疗和放疗的原发性浸润性乳 腺癌及相应癌旁组织192例，平均年龄60 (18~93) 岁，随访时间(2~78) 月，平均51月。其中乳腺浸 润性导管癌共160例，浸润性小叶癌10例，浸润性 髓样癌9例，浸润性黏液癌1例；高-中分化腺癌96 例，低分化腺癌61例；有淋巴结转移者71例。39 例淋巴结转移情况、35例分化级别、23例组织学 分类、12例肿瘤组织学类型、15例肿瘤大小、5例 雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）表达情 况、77例倍数性及21例HER2表达情况数据缺乏， 具体资料见 表1。另取40例良性乳腺肿瘤患者的瘤 旁正常乳腺组织作为对照组。经西澳大利亚人类 研究伦理委员会批准研究。

表 1(Table 1)

表1 RARβ基因甲基化与乳腺癌临床病理的关系[例数(%)] Table 1Relationship between RARβgene promoter methylation and clinicopathological features of breast cancer[n(%)]

表1 RARβ基因甲基化与乳腺癌临床病理的关系[例数(%)] Table 1 Relationship between RARβgene promoter methylation and clinicopathological features of breast cancer[n(%)]

用亚硫酸氢钠修饰 DNA，MSP检测基因甲基化状态^{[5, 6]}。1~2 μg DNA用 15 μl水溶解后加入1.7 μl 2M NaOH，混匀。37℃水 浴15 min。加入9 μl对苯二酚（1 mg/ml）和156 μl新 鲜制备的亚硫酸氢钠溶液（380 mg/ml），混匀； 最 后加滴50 μl矿物油，55℃水浴16 h。重亚硫酸盐修 饰后的DNA采用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯 化(Qiagen公司)，具体步骤按操作说明进行。经50 μl 10 mM Tris-HCl (pH=8.0)洗涤，和5.5 μl 3M NaOH 脱磺基后，混匀室温下孵育15 min。然后再加入6 μl 3M醋酸钠（pH=5.2）、1 μl糖原(20 mg/ml)和180 μl 无水冰乙醇进行沉淀。随后将样品离心30 min后， 放置在-80℃30 min。小心吸去上清液，让管子在室 温下晾干，之后再加入20 ml Milli-Q水溶解。这种 亚硫酸氢钠修饰后的DNA随即直接用于PCR扩增。 1.2.2 引物设计

RARβ甲基化上游引物：5’-CG AGCGGGCGTAGGCGGAATATC-3’,下游引物： 5’-CAAACAACGAACGCACAAACCGACG-3’，扩 增产物为200 bp，退火温度为67℃，MgCl2浓度为2.5 mM；RARβ非甲基化上游引物：5’-GGTGAGTGGG TGTAGGTGGAATATT-3’,下游引物：5’-AACAAAC AACAAACACACAAACCAACAT-3’，扩增产物为 200 bp，退火温度为67℃，镁离子浓度为2.5 mM。 1.2.3 甲基化特异性PCR检测

Master mix 18 μl， 包括：修饰后的DNA 2 μl，1×聚合缓冲液，1×Q 液，2.5 mM MgCl2，上下游引物各0.4 μM，和Taq 酶0.1 μl （Qiagen公司）。PCR扩增条件：：94℃ 预变性5 min，热循环94℃变性30 s，67℃退火45 s ，72℃延伸30 s，RARβ基因非甲基化循环35周 期，RAR基因甲基化循环38周期后，最后72℃延 伸7 min。用经SSS1酶处理的和未处理的正常人外 周血DNA作为甲基化及非甲基化的阳性对照。最 后，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，如甲 基化引物扩增有条带则说明该样本发生了甲基化。 1.3 统计学方法

所有实验数据，均使用SPSS 17.0软件进行统计学 处理分析。采用χ²检验分析RARβ基因甲基化和乳腺 癌临床病理特点的关联性，Kaplan-Meier分析用来评 估累积生存率，而差异使用Log rank检验进行了评估。 2 结 果 2.1 RARβ基因的甲基化检测结果

40例正常乳腺组织中无一例检测到RARβ基因 甲基化，192例乳腺癌组织中50例有RARβ基因甲基 化（26%），差异有统计学意义(P<0.05)。运用MSP 技术检测乳腺癌RARβ基因甲基化的结果，见图 1。

图 1 MSP分析法检测RARβ基因甲基化情况 Figure 1 RMSP analysis of RARβgene methylation in primary breast carcinomas

χ²检验统计结果显示，RARβ基因甲基化率与 患者年龄、PR表达情况、倍数性及TP53突变无明 显相关性(P>0.05)。淋巴结转移、ER阴性及HER2 过度表达的癌组织中RARβ基因甲基化率增高，但 无统计学意义。直径>20 mm、Ⅲ期乳腺癌及浸润 性非导管型乳腺癌的RARβ基因甲基化率明显增高 (P<0.05)。在浸润性非导管型乳腺癌类型中RARβ 基因甲基化率最高（50%），见表1。RARβ基因 甲基化的肿瘤PR平均值（x±s）为（154±262） fmol/μg，高于无RARβ基因甲基化肿瘤PR平均值 （91±154）fmol/μg（P=0.04）。 2.3 RARβ基因甲基化与预后的关系

在本组乳腺癌患者，一些传统指标，如淋巴结 转移（P＜0.001）、肿瘤大小（P＜0.001）、组织 学分级（P＜0.001）、TP53突变（P=0.002），均 与预后显著相关。RARβ基因甲基化与预后亦显示 类似的结果，生命曲线分析显示RARβ基因甲基化 的乳腺癌患者平均生存65.53（59.21~71.85）月，低 于无RARβ基因甲基化患者的69.06（65.84~72.28） 月，然而经Log rank检验，两组生存率曲线的差别 无统计学意义（χ²=1.23，P＝0.268），见图 2A。

图 2 乳腺癌患者RARβ基因有无甲基化Kaplan–Meier分析生存率曲线图 Figure 2 Kaplan-Meier survival analysis for breast cancer patients with and without RARβmethylation

在淋巴结转移的乳腺癌患者中，RARβ基因甲基化的患者平均生存52.43（40.56~64.30）月，明显低 于RARβ基因无甲基化的患者的73.13（65.12~81.14） 月，经Log rank检验，两组生存率曲线的差别有统计 学意义（χ²=4.230，P＝0.040），见图 2B。另外，在肿 瘤直径>20 mm（χ²=3.353，P＝0.067）和ER受体阳性 （χ²=3.149，P＝0.076）的乳腺癌，RARβ基因甲基化 的患者均显示较差的预后结果，但无统计学意义。 3 讨论

本研究的目的是为了检测RARβ基因的甲基化 是否与乳腺癌的某些特异性表型包括预后相关联。 在大肠癌首次提出这种DNA甲基化特异性表型的发 现，被称为CpG岛甲基化表型（CIMP+）的一类大 肠癌^[7]。那么，在乳腺癌是否也存在这种表型呢？

本实验用于检测RARβ基因甲基化的乳腺癌标 本的临床病理资料完整，一些传统的预后指标， 如淋巴结转移、组织学分级、肿瘤大小和TP53突 变，均具有统计学意义^[8]。实验标本为新鲜冰冻的 乳腺癌组织，应用甲基化特异性PCR检测甲基化率 可达99.4% (1 343/1 351)。据文献报道，乳腺癌的 单个基因的甲基化率变化很大，可能与DNA的质 量、PCR循环周期和扩增条件有关。而且在不同基 因间甲基化特异性PCR的敏感度因PCR效率及其产 物的大小不同存在差异。因此，在目前研究中，我 们对每个肿瘤DNA标本采用相同的实验条件，以 达到不同标本之间相对甲基化率的有效可比性。

在一项RARβ基因功能性研究的实验中证实^[9]， RARβ基因具有与TP53基因一样抑制肿瘤生长的作 用。近年来，一些研究阐述了在乳腺恶性组织细胞 中RARβ基因mRNA的表达水平下降，而在正常乳 腺上皮细胞RARβ基因有表达，这些发现都表明了 RARβ基因mRNA表达的缺失可能是乳腺癌发生的 一个重要因素，并且是早期阶段^[10]。RARβ基因位于 3p24上，该区域存在着乳腺癌杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）的高概率（45%）^[11]。但 是， LOH不能作为一个独立的因素抑制RARβ基因的表 达，因此，通过其进一步的研究证明，RARβ启动子 5’端区域的甲基化与乳腺癌发生具有重大的关系^[12]。

本实验结果表明，乳腺癌组织及其癌旁组织 RARβ基因甲基化检出率差异有统计学意义，且乳腺癌中RARβ基因甲基化与肿瘤分期(P=0.010)、 肿瘤大小(P=0.012)呈正相关。这些发现把DNA 甲基化和乳腺癌的组织学特性关联起来，因而 显得重要。以往的研究结果亦有报道，基因CpG 岛甲基化与恶性程度高的乳腺癌相关，如ER、 E-cadherin、p16等基因^{[13, 14]}。国外已有几个研究组 报道了CIMP+型大肠癌与恶性程度的相关性^{[15, 16, 17]}， 这表明这种DNA甲基化特异性表型的出现可能广 泛存在于人类癌症中。因此，我们认为RARβ基因 甲基化与恶性程度高的乳腺癌相关。

本研究还发现在浸润性非导管型乳腺癌中 RARβ基因甲基化率最高（50%），而Fackler等^[18] 则认为RARβ基因甲基化对导管型乳腺癌和小叶型 乳腺癌同样重要。由于标本量小，本研究无法确 认RARβ基因甲基化与乳腺癌的某种组织分型是否 存在CIMP+表型。淋巴结转移、ER阴性、PR阴性 及HER2过度表达的癌组织中RARβ基因甲基化率 增高，但无统计学意义。所有这些发现均需要更 大的实验来研究，并且进一步明确乳腺癌的表型 特征是否与甲基化所致的基因失表达或其他机制 相关联。

鉴于RARβ基因甲基化与晚分期及直径>20 mm 乳腺癌的相关性，即RARβ基因甲基化与恶性程 度高的乳腺癌相关，可以推测此基因的甲基化提 示预后差。而且在淋巴结转移的肿瘤中，RARβ 基因甲基化的乳腺癌患者生存率显著下降（P＝ 0.040）。既往有研究报道CDH1和CCND2基因甲 基化提示乳腺癌患者预后差^{[19, 20]}，Widschwendter 等^[21]亦发现ER基因甲基化具有相似的预后价值， 而且与内分泌治疗和化疗相关。因此与以往的研 究结果一致，我们认同基因甲基化对乳腺癌的预 后具有重要作用，虽然证据较薄弱，关于乳腺癌 DNA甲基化特异性表型的存在与否需要更多的病 例和其他基因加入研究来进一步明确。

总之，本研究证实，RARβ基因甲基化仅存在 于乳腺癌组织中，正常乳腺组织中无一例。乳腺 癌中RARβ基因甲基化与肿瘤分期和肿瘤大小的 相关性，表明RARβ基因甲基化在判定肿瘤预后起 重要作用。尤其是淋巴结转移的乳腺癌，RARβ基 因甲基化提示预后差。RARβ基因甲基化的研究对 于进一步明确乳腺癌的发病机制、早期诊断和预 后，以及乳腺癌DNA甲基化特异性表型的存在与 否具有重大的理论和临床意义。