乳腺癌在女性恶性肿瘤中所占比重逐年递 增，死亡率也呈上升趋势。乳腺癌是一种高度异 质性生物学特性的恶性肿瘤，其分子分型对于预 后判断和治疗具有重要指导作用。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）属于乳腺 癌中的一种特殊类型，是指雌激素受体（ER）、 孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体 （HER2）表达缺失的乳腺癌，约占所有类型乳腺 癌的15%^[1]。由于缺乏相应靶点不能进行内分泌及 生物治疗,目前这类特殊类型乳腺癌的治疗仅限于 化疗,但效果欠佳,患者的局部复发和远处转移率 较高,预后较差。目前认为其不良的预后与其侵袭 性生物学行为及对现有治疗手段抵抗有关^{[2, 3]}。因 此，本文就TNBC的生物学特征作进一步深入研 究，以期发现更多治疗靶点、分子预测指标。 1 资料与方法 1.1 临床资料

收集2010年1月—2012年10月南京军区福州总 医院肿瘤科初诊并确诊为乳腺癌的患者227例，其 中三阴性乳腺癌51例，非三阴性乳腺癌176例。术 前均未接受化疗、放疗、内分泌治疗以及靶向治 疗等，且所有患者均经过明确的病理诊断，并记 录了完整的临床病例资料，包括一般情况、病理 诊断、肿瘤分期、免疫组织化学检测指标等。 1.2 方法

应用免疫组织化学SP方法，按试剂盒说明 书进行操作。检测227例乳腺癌患者ER、PR、 HER2、TOPOⅡ、Ki67、β-tubulin Ⅲ、BRCA1和 ERCC1的表达，切片脱蜡水化，制成5μm厚连续 切片；抗原热修复处理，Citrate缓冲液；微波中火 煮沸10 min,冷却；蒸馏水洗后，浸入30 ml/L过氧 化氢5 min；蒸馏水冲洗，再经PBS缓冲液洗，加 入一抗，孵育30 min；PBS缓冲液洗后3遍，每次2 min，加入En-Vision孵育30 min；PBS缓冲液冲洗3 次，每次2 min，加DAB显色；蒸馏水洗后，苏木 精对比染色，PBS代替一抗做阴性对照，同时用已 知的阳性切片在同条件下染色设立阳性对照。 1.3 评价标准

乳腺癌肿瘤最大直径≤2 cm为T1；T2：＞2 cm且≤5cm；T3：＞5cm；T4：无论肿瘤大小， 直接侵及胸壁或皮肤。淋巴结无转移用（－）表 示，一个或多个转移用（+）表示。临床分期按乳 腺癌临床分期标准见病理报告直接记录。

按试验手册说明进行结果判定，以细胞核 呈棕黄色颗粒计为阳性细胞。TOPOⅡ、Ki67、 β-tubulin Ⅲ、BRCA1和ERCC1的阳性部位定位于 细胞核，HER2阳性部位定位于细胞膜。根据肿瘤 细胞的阳性数进行判定，用高倍视野随机计数500 个肿瘤细胞，计算阳性细胞的百分数。阳性细胞 表达数＜10%为阴性（－），10%~25%为（+）， 26%~50%为（++），＞50%~75%为（+++），＞ 75%为（++++）。

根据美国临床肿瘤协会和美国病理学医师 学院2006年发表的HER2/neu检查临床实践指 南，（++）用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridzation，FISH）进行验证。HER2/neu免疫组 织化学染色0分或（+）被判定为阴性，（+++以 上）被判定为阳性。Ki67、TOPOⅡ、BRCA1和 ERCC1以（－）与（+）归为低水平表达，（++） ~（++++）为高水平表达。β-tubulin Ⅲ（－）与 （+）、（++）定义为低水平表达，（+++）~ （++++）定义为高水平表达。

HER2、ER、PR≤1%为阴性，＞1%为阳性。 ER、PR、HER2均阴性者定义为三阴组，三项中 有任何一项阳性者定义为非三阴组。 1.4 统计学方法

应用SPSS16.0 软件包进行统计处理，临床资 料的分析采用卡方检验进行处理，所有结果均以P ＜0.05表示差异有统计学意义。 2 结果

2.1 乳腺浸润性导管癌组织中BRCA1、TOPO Ⅱ、β-tubulinⅢ、ERCC1和Ki67的表达情况

免疫组织化学结果见图 1。

A: BRCA1 expression in cell nucleus and plasmas of mammary carcinoma;B:TOPOⅡexpression in cell nucleus of mammary carcinoma;C:β-tubulin Ⅲexpression in cell nucleus and membrane of mammary carcinoma;D:ERCC1 expression in cell nucleus of mammary carcinoma;E:Ki67 expression in cell nucleus of mammary carcinoma;F:the positive expression of Ki67 in adjacent to carcinoma; BRCA1:breast cancer susceptibility gene-1; TOPOⅡ:topoisomeraseⅡ;ERCC1:excision repair cross complementation group 1 图 1 乳腺浸润性导管癌组织中BRCA1、TOPOⅡ、β-tubulinⅢ、ERCC1和Ki67免疫组织化学染色结果（SP ×100） Figure 1Expression of BRCA1,TOPOⅡ,β-tubulinⅢ,ERCC1 and Ki67 in breast infiltrating ductal carcinoma tissues by immunohistochemistry (SP ×100)

两组乳腺癌患者中，51例三阴组中在绝经前 发病者31例（60.8%），组织分级Ⅱ级以上者占33 例（64.7%），与非三阴组相比差异有统计学意义 （P＜0.05）；肿瘤大小、淋巴结是否转移、临床 分期差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。 2.3 三阴组与非三阴组乳腺癌患者生物学特征比较

三阴组乳腺癌组中，TOPOⅡ低水平表达 33例（64.7%），β-tubulin Ⅲ高水平表达36例 （70.6%），ERCC1低水平表达有39例（76.5%）， BRCA1和ERCC1共同低水平表达26例（51.0%）， 与非三阴组中相比较差异均具有统计学意义 （P＜0.05）。BRCA1高水平表达率为36例 （70.6%），Ki67高水平表达性38例（74.5%），两 组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表 1(Table 1)

表1 三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌临床病理特征与生物学免疫组织化学统计结果[例（%）] Table 1 Clinicopathologic features and immunohistochemistry of TNBC and NTNBC [n (%)]

表1 三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌临床病理特征与生物学免疫组织化学统计结果[例（%）] Table 1 Clinicopathologic features and immunohistochemistry of TNBC and NTNBC [n (%)]

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种特殊 类型，由于缺乏相应的激素受体和HER2/neu靶基 因的表达而无法从内分泌与靶向治疗中获益。这 一类型乳腺癌有着“特例独行”的生物学行为，对 化疗敏感度的预测是化疗中研究的热点。近年来 较多学者开始关注TNBC并针对其临床生物学、分 子生物学特征以及临床治疗策略进行深入研究。 与非三阴性乳腺癌相比，三阴性乳腺癌患者具有在绝经前发病、组织分级较高等高危特点， 对于临床判断有积极意义。

拓扑异构酶(TOPOⅡ)是细胞增殖过程中关键 的酶类，同时也是多种化疗药物的靶点，包括蒽 环类、嘧啶拮抗剂以及氟尿嘧啶等。拓扑异构酶 Ⅱ主要存在于S期细胞，其表达降低可引起药物作 用分子靶点减少，导致药物失去杀伤肿瘤细胞的 作用，影响肿瘤化疗的敏感度甚至引起耐药，细 胞内TOPOⅡ表达水平越高，对以TOPOⅡ为靶点 的化疗药物敏感度越好，反之则越低^[4]。该文献同 时显示，TOPOⅡ表达与局部分期、肿瘤大小存在 统计学差异，与腋窝淋巴结转移和肿瘤远处转移 有关，与临床分期未发现相关性。因此，TOPOⅡ 可能成为临床预后的重要预测指标之一^[5]。本研 究显示TOPOⅡ在三阴组、非三阴组中的低水平表 达率分别为64.7%、40.9%，差异具有统计学意义 （P=0.017）。

Ki67是一种在增殖细胞中表达的核抗原，其 表达能反映肿瘤的细胞增殖活性，是公认的细胞 增殖活性标志物，与恶性肿瘤的发展、转移、预 后相关^[6]。存在于细胞周期中除G0期以外所有阶段 细胞核增殖标志物，因此成为检测肿瘤细胞增殖 活性较可靠的指标。有研究表明，多种实体恶性 肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织。本研究显示Ki67在三阴组和非三阴组中高表达水平率分别为 74.5%、61.4%，差异无统计学意义（P=0.350）。

β微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）是紫杉醇作用 的位点，与紫杉醇的获得性耐药密切相关。一些 基础和临床研究证实，β-tubulinⅢ的表达与紫杉 醇化疗敏感度相关，可作为一些实体肿瘤（肺 癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、不明原发部 位的肿瘤）预后的评价指标^[7]。Sève等^[8]研究提 示β-tubulin Ⅲ高表达与紫杉醇耐药有关。但是 β-tubulin Ⅲ与乳腺癌的相关性目前研究报道甚 少。本研究显示β-tubulin Ⅲ在三阴组中高表达率 为70.6%，在非三阴组中高表达率为47.7%，差异 有统计学意义（P=0.002）。

乳腺癌易感基因1（BRCA1）是一个定位于 人体第17号染色体的抑癌基，其结构和功能的异 常与乳腺癌的发病密切相关。与不携带BRCA1突 变的乳腺癌相比，BRCA1相关性乳腺癌组织分 化差、ER和PR常呈阴性，提示预后可能较差。 Okada等^[9]研究发现BRCA1突变者的腋窝淋巴结转 移率高。临床研究证实，BRCA1表达水平低的患 者对铂类药物敏感，表达水平高的患者则表现对 铂类药物耐药^[10]。目前，BRCA1能否作为一个独 立的预后指标仍有争议，有待进一步研究证实。 本研究显示BRCA1在三阴组中低表达率为29.4%，在非三阴组中高表达率为39.8%，差异有统计学意 义（P=0.210）。

切除修复交叉互补基因l(ERCC1)作为DNA 损伤修复系统中的一个关键基因，在NER途径中 起着重要作用。部分TNBC有一定程度的ERCC1 表达，乳腺癌中ERCC1的表达与顺铂耐药有关， ERCC1表达水平低的患者对铂类药物敏感，以铂 类药物为基础的化疗方案可能对这部分患者有较 好的疗效。本组研究中ERCC1在三阴组中低表达 率为76.5%，在非三阴组中高表达率为51.3%，差 异具有统计学意义（P=0.038）。

BRCA1与ERCC1均属于DNA修复基因，并 且与铂类化疗药物的敏感度有关。Sidoni等^[11]在 81例三阴性乳腺癌中检测ERCC1的表达情况， 发现评分≥1的ERCC1阳性病例为26例(32%)，并 且ERCC1的表达与其他主要临床病理因素不相 关。因此本研究中，将两指标合并为BRCA1与 ERCC1共表达作为一个因素进行分析，具有重要 的临床意义。本研究显示，在三阴组和非三阴组 中BRCA1和ERCC1共表达阴性率分别为51.0%、 26.1%，差异具有统计学意义（P=0.033）。在对 TNBC患者予以含铂方案治疗时，可先检测其肿瘤 组织的BRCA1、ERCC1表达状况以预测疗效。

综上所述，TOPOⅡ低表达者对含蒽环类药 物相对耐药，反之疗效较好。β-tubulin Ⅲ与含紫 杉类药物的敏感度有关，高表达者对紫杉醇耐药 性增高，低表达者对紫杉醇较敏感。BRCA1、 ERCC1参与铂类化疗药物耐药的发生，可作为 三阴性乳腺癌对顺铂治疗敏感的特异性分子标志 物，有望用于预测顺铂疗效，高表达者对铂类的 辅助化疗更敏感。因此，判断三阴性乳腺癌的生 物学特性，为具体有效的个体化综合治疗方案提 供理论依据，对于预后判断也有积极意义。