胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，2008年 全球新发胃癌患者989 600例，占所有新发癌症 病例的8%，死亡738 000例，占所有死亡病例的 10% ^{[ 1 ]}。E-钙黏素（E-cadherin）在细胞-细胞黏附中起重要作用，其编码基因的胚系突变失活与 散发家族性胃癌有关；大量研究使E-cadherin在 肿瘤形成的早期阶段的作用得到公认，除此之外 E-cadherin在肿瘤进展、侵袭迁移及代谢方面均起 着非常关键的作用^{[ 2 ]}。环氧合酶-2（COX-2）是一 种诱导型表达蛋白，催化花生四烯酸生成前列腺 素，参与炎症、肿瘤血管形成及肿瘤侵袭转移等 多种病理生理过程^{[ 3 ]}。研究表明，COX-2在散发型 胃癌的原发灶及其转移淋巴结中均有表达，且后者 的表达明显升高，提示COX-2与肿瘤转移有关^{[ 4 ]}。 流行病学数据显示，服用非甾体类消炎药与胃癌 患病风险降低有关；而选择性COX-2抑制剂不仅 可以降低健康人群罹患胃癌的风险，且具有较小 的胃肠道及心血管不良反应适于胃癌高危人群的 一级预防，但非甾体类消炎药化学防癌的分子机 制尚未完全阐述清楚^{[ 5 ]}。本实验通过以不同剂量的 选择性COX-2抑制剂塞来昔布（Celecoxib）和外 源性PGE₂对人胃癌细胞株SGC-7901进行干预，研 究COX-2对人胃癌细胞SGC-7901中E-cadherin表达 及迁移能力的影响。 1 材料与方法 1.1 材料

SGC-7901人胃癌细胞购于中国科学院上海 生命科学研究院。塞来昔布与PGE₂纯品由香港大 学医学院馈赠。新生牛血清和胎牛血清均购于杭 州四季青公司，RPMI 1640购于美国Gibco公司， Transwell小室购于美国Millipore公司。E-cadherin 兔抗人抗体和FITC标记羊抗兔抗体购于美国 Bioworld公司。ZE Spin Colum Total RNA Isolation Kit、PrimeScriptTM RT Reagent kit、SYBP^®Premix Ex TaqTM均购于日本TaKaRa公司。 1.2 实时荧光定量RT-PCR检测COX-2、E-cadhrein 的表达

常规培养细胞并加入药物干预，按照柱式 提取试剂盒说明提取RNA，反转录为cDNA，以 cDNA为模板进行PCR反应，人COX-2基因片段 扩增引物序列为：F：5′- TGGTGCCTGGTCTGA TGATGTATGC -3′，R：5′- ATCTGCCTGCTCTG GTCAATGGAAG -3′，扩增片段长度为125 bp。 人E-cadherin基因片段扩增引物序列为：F：5′- TTAAACTCCTGGCCTCAAGCAATC -3′，R：5′- TCCTATCTTGGGCAAAGCAACTG -3′，扩增片 段长度为108 bp。PCR反应体系SYBP^®Premix Ex Taq^TM12.5 μl，cDNA模板2 μl，引物各1 μl，ddH₂O 8.5 μl。反应条件：95℃、30 s；95℃、5 s；62℃、 30 s；40个循环。采用2^-△△CT公式计算目的基因相对 表达量。实验重复四次取平均值进行统计学分析。 1.3 细胞免疫荧光标记法结合荧光共聚焦显微镜 检测E-cadherin蛋白表达

常规培养细胞进行爬片，分别以塞来昔布30 μmol/L 处理0、24、36、48、60、72h和PGE₂1 μmol/L处理 0、12、24、48 h后取出盖玻片，冰丙酮:甲醇(1:1)固 定10 min，10 g/L BSA封闭30 min，加入 一 抗(1∶ 100)4℃孵育过夜，PBS洗涤并加入二抗(1∶200)37℃ 暗盒孵育2 h后封片，以PBS替代一抗作为阴性对 照。激光共聚焦荧光显微镜下扫描，每高倍视野随 机选取3个肿瘤细胞，利用Leica confocal software软 件计算荧光强度，实验重复3次取平均值。 1.4 Transwell小室法检测肿瘤细胞体外迁移能力

制作单细胞悬液（5×10⁵/ml），30 μmol/L塞 来昔布或1 μmol/L PGE₂加入单细胞悬液并混匀。 上室中加入200 μl药物与细胞的混悬液，下室加入 600 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液作为趋 化力，继续培养24 h后取出小室，拭去小室滤膜上 表面未穿出的细胞，瑞士染液染色20 min，倒置显 微镜200倍镜下分别选取滤膜下表面上、下、左、 右、中心5个视野计数，其平均细胞数进行统计分 析，各组设3个复孔。 1.5 统计学方法

计量资料结果以均数±标准差（x±s）表示， 采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理，多个样 本均数的比较采用单因素方差分析，两样本均数 的比较采用两独立样本t检验，两变量之间的相关 性检验用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有 统计学意义。 2 结果 2.1 实时荧光定量RT-PCR检测COX-2、 E-cadherin mRNA的表达量及相关性分析

塞来昔布按照10、20、30、40、50 μmol/L干 预SGC-7901细胞24 h后，COX-2 mRNA的表达量 与0 μmol/L组相比明显降低，其中20、30、40、 50 μmol/L浓度组与0 μmol/L组相比差异具有统计 学意义（P＜0.01）；而E-cadherin mRNA的表达 量则呈逐渐升高趋势，30、40 μmol/L两个浓度组 E-cadherin mRNA的表达量与0 μmol/L组相比差异 有统计学意义（P＜0.01），且呈浓度依赖性增 高，见表1。塞来昔布30 μmol/L浓度处理SGC-7901 胃癌细胞12、24、36、48 h后，COX-2 mRNA的相对表达量降低，与0 h比差异有统计学意义（P＜0.01）； 相反的，E-cadherin mRNA的相对表达量逐渐升高， 36、48 h与0 h组相比差异有统计学意义（P＜0.01）， 见表2。PGE₂按照0.1、1、5、10 μmol/L的浓度干预 SGC-7901细胞24 h，E-cadherin mRNA表达量逐渐下 降，分别为（0.68±0.02）、（0.48±0.007）、（0.24±0.03）、 （0.30±0.01），与0 μmol/L（1.00±0.00）相比 差 异 具 有 统 计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。给予PGE₂1 μmol/L浓 度处理后，12、24、48 h E-cadherin mRNA表达量依次 为（0.65±0.03）、（0.54±0.11）、（0.57±0.13）与0 h组（1.00 ±0.00）相比 明 显 降 低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 采用曲线拟合描述COX-2与E-cadherin mRNA表达 的关系并进行差异性检验（P＝0.04），说明COX-2与 E-cadherin mRNA表达之间呈负相关关系。

表1(Table 1)

表1 不同浓度塞来昔布处理SGC-7901细胞24 h后COX-2与E-cadherin mRNA表达的变化（x±s,n=4） Table 1 Expressions of COX-2 and E-cadherin mRNA in SGC-7901 after treatment with different concentrations of Celecoxib for 24 h(x±s,n=4) Notes：■ and ▲：P＜0.01, compared with 0 μmol/L,When Celecoxib reached to 50 μmol/L, it could inhibit cells growth dramitically, which could decrease E-cadherin expression too

表1 不同浓度塞来昔布处理SGC-7901细胞24 h后COX-2与E-cadherin mRNA表达的变化（x±s,n=4） Table 1 Expressions of COX-2 and E-cadherin mRNA in SGC-7901 after treatment with different concentrations of Celecoxib for 24 h(x±s,n=4)

表2(Table 2)

表2 30 μmol/L塞来昔布处理SGC-7901细胞不同时间COX-2与E-cadherin mRNA表达的变化（x±s,n=4） Table 2 Expressions of COX-2 and E-cadherin mRNA in SGC-7901 treated with 30 μmol/L Celecoxib for different time(x±s,n=4) Notes：■ and ▲：P＜0.01, compared with 0 h

表2 30 μmol/L塞来昔布处理SGC-7901细胞不同时间COX-2与E-cadherin mRNA表达的变化（x±s,n=4） Table 2 Expressions of COX-2 and E-cadherin mRNA in SGC-7901 treated with 30 μmol/L Celecoxib for different time(x±s,n=4)

塞来昔布30 μmol/L作用24、36、48 h后E-cadherin 平均荧光强度分别为（23.94±5.66）、（53.14±11.49）、 （21.23±7.65），E-cadherin蛋白的表达量明显增加， 与对照组（14.54±3.13）相比差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。PGE₂1 μmol/L处理SGC-7901细胞24、 48 h后，E-cadherin的平均荧光强度值分别为（16.1 ±0.43）、（10.3±0.8），其表达量明显降低，与对照组 （29.11±0.41）相比 差 异 均 有 统 计 学 意 义（P＜0.05），见 图2。

A:control;B,C and D:fluorescence intensity of E-cadherin after treatment with Celecoxib for 24, 36 and 48 h 图1 塞来昔布30 μmol/L处理SGC-7901细胞不同时间后E-cadherin蛋白表达的变化 Figure 1 E-cadherin protein expression in SGC-7901 treated with 30 μmol/L celecoxib for different time

A:control; B and C: fluorescence intensity of E-cadherin after treatment with PGE2for 24 and 48 h 图2 PGE21μmol/L处理SGC-7901细胞不同时间E-cadherin蛋白表达的变化 Figure 2 E-cadherin protein expression in SGC-7901 after treated with 1 μmol/L PGE2for different time

以30 μmol/L的塞来昔布作用于SGC-7901胃癌细 胞24 h后，计算穿膜细胞数为（15±5.9）个/高倍视野， 比对照组（75±12.3）个/高倍视野明显减少，差异有 统计学意义（t=16.196，P=0.000）。以1 μmol/L的PGE₂ 作用于体外培养的SGC-7901胃癌细胞24 h后，计算 穿膜细胞数为（120±16.78）个/高倍视野，比对照组 （75±12.3）个/高倍视野明显增加，差异有统计学意义 （t=-3.575，P=0.005）。 3 讨论

胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，在中国每 年新增约36~40万胃癌患者，死亡率占据我国肿 瘤死因的第二位^{[ 6 ]}。转移是恶性肿瘤最具破坏性 的特征，亦是导致恶性肿瘤死亡的首要因素，大 量研究证实，环氧合酶2（COX-2）在恶性肿瘤的 发生发展进程中发挥着重要的作用，因而其与恶 性肿瘤的关系倍受关注。目前认为，COX-2主要 通过催化花生四烯酸使前列腺素E2（PGE₂）产生 增加而参与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移^{[ 7 ]}。 E-cadherin是钙黏素家族的主要成员，在细胞-细胞 黏附中起重要作用，其功能缺失将破坏上皮细胞-细胞黏附功能，改变基质间的相互作用，转变细胞 迁移及信号使其具有癌细胞特征^{[ 2 ]}。研究显示，肿 瘤进展阶段常伴有E-cadherin功能的缺失，使癌细 胞具有向临近组织侵袭及向远处转移的能力^{[ 8 ]}。

大量研究发现COX-2与E-cadherin在消化道肿 瘤中存在调控关系。Bocca等^{[ 9 ]}发现，罗非昔布能 够上调结肠癌细胞膜β-catenin/E-cadherin的表达 并抑制细胞增殖。Shar等^{[ 10 ]}使用塞来昔布对29例 Barrett's 食管癌患者进行二级预防，随访一年后 发现与未干预组相比，干预组患者Barrett's 食管 癌明显好转，其分子标志物E-cadherin表达较对 照组升高。本研究显示：在体外实验中，塞来昔 布特异性抑制了SGC-7901胃癌细胞中COX-2的表 达，E-cadherin 表达量随着COX-2 表达下降呈剂量 和时间依赖性增高并出现明显的胞膜聚集现象，而肿瘤细胞迁移数量明显下降；另一方面，在加 入COX-2催化产物PGE₂后E-cadherin表达明显下 调，肿瘤细胞迁移数量明显增加；统计学分析发 现COX-2与E-cadherin的表达水平呈负相关关系。 与我们的研究相似，Sitarz等^{[ 11 ]}研究发现，COX-2 在传统的胃癌细胞系中上调E-cadherin转录及蛋白 的表达，在早发性胃癌细胞株中下调E-cadherin 的表达。上述结果均提示在SGC-7901细胞系中 E-cadherin的表达可能受COX-2的调控，COX-2抑 制剂的化学防癌机制可能与上调E-cadherin的表达 并进一步抑制肿瘤细胞迁移有关。但胃癌细胞中 COX-2调控E-cadherin 表达的信号转导通路尚需进 一步实验进行阐明。

本研究结果显示在体外实验中塞来昔布能 够抑制胃癌侵袭迁移并上调E-cadherin的表达； 而加入外源性的PGE₂后促进胃癌细胞迁移并使 E-cadherin的表达下调。上述结果表明COX-2可能 通过调控E-cadherin参与肿瘤转移过程，提示非甾 体类消炎药（NSAIDs）的化学防癌机制可能与抑 制肿瘤细胞的迁移有关，为临床治疗胃癌提供了 新的思路和靶点。