胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一,2008年 全球新发胃癌患者989 600例,占所有新发癌症 病例的8%,死亡738 000例,占所有死亡病例的 10% [ 1 ]。E-钙黏素(E-cadherin)在细胞-细胞黏附中起重要作用,其编码基因的胚系突变失活与 散发家族性胃癌有关;大量研究使E-cadherin在 肿瘤形成的早期阶段的作用得到公认,除此之外 E-cadherin在肿瘤进展、侵袭迁移及代谢方面均起 着非常关键的作用[ 2 ]。环氧合酶-2(COX-2)是一 种诱导型表达蛋白,催化花生四烯酸生成前列腺 素,参与炎症、肿瘤血管形成及肿瘤侵袭转移等 多种病理生理过程[ 3 ]。研究表明,COX-2在散发型 胃癌的原发灶及其转移淋巴结中均有表达,且后者 的表达明显升高,提示COX-2与肿瘤转移有关[ 4 ]。 流行病学数据显示,服用非甾体类消炎药与胃癌 患病风险降低有关;而选择性COX-2抑制剂不仅 可以降低健康人群罹患胃癌的风险,且具有较小 的胃肠道及心血管不良反应适于胃癌高危人群的 一级预防,但非甾体类消炎药化学防癌的分子机 制尚未完全阐述清楚[ 5 ]。本实验通过以不同剂量的 选择性COX-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)和外 源性PGE2对人胃癌细胞株SGC-7901进行干预,研 究COX-2对人胃癌细胞SGC-7901中E-cadherin表达 及迁移能力的影响。 1 材料与方法 1.1 材料
SGC-7901人胃癌细胞购于中国科学院上海 生命科学研究院。塞来昔布与PGE2纯品由香港大 学医学院馈赠。新生牛血清和胎牛血清均购于杭 州四季青公司,RPMI 1640购于美国Gibco公司, Transwell小室购于美国Millipore公司。E-cadherin 兔抗人抗体和FITC标记羊抗兔抗体购于美国 Bioworld公司。ZE Spin Colum Total RNA Isolation Kit、PrimeScriptTM RT Reagent kit、SYBP®Premix Ex TaqTM均购于日本TaKaRa公司。 1.2 实时荧光定量RT-PCR检测COX-2、E-cadhrein 的表达
常规培养细胞并加入药物干预,按照柱式 提取试剂盒说明提取RNA,反转录为cDNA,以 cDNA为模板进行PCR反应,人COX-2基因片段 扩增引物序列为:F:5′- TGGTGCCTGGTCTGA TGATGTATGC -3′,R:5′- ATCTGCCTGCTCTG GTCAATGGAAG -3′,扩增片段长度为125 bp。 人E-cadherin基因片段扩增引物序列为:F:5′- TTAAACTCCTGGCCTCAAGCAATC -3′,R:5′- TCCTATCTTGGGCAAAGCAACTG -3′,扩增片 段长度为108 bp。PCR反应体系SYBP®Premix Ex TaqTM12.5 μl,cDNA模板2 μl,引物各1 μl,ddH2O 8.5 μl。反应条件:95℃、30 s;95℃、5 s;62℃、 30 s;40个循环。采用2-△△CT公式计算目的基因相对 表达量。实验重复四次取平均值进行统计学分析。 1.3 细胞免疫荧光标记法结合荧光共聚焦显微镜 检测E-cadherin蛋白表达
常规培养细胞进行爬片,分别以塞来昔布30 μmol/L 处理0、24、36、48、60、72h和PGE21 μmol/L处理 0、12、24、48 h后取出盖玻片,冰丙酮:甲醇(1:1)固 定10 min,10 g/L BSA封闭30 min,加入 一 抗(1∶ 100)4℃孵育过夜,PBS洗涤并加入二抗(1∶200)37℃ 暗盒孵育2 h后封片,以PBS替代一抗作为阴性对 照。激光共聚焦荧光显微镜下扫描,每高倍视野随 机选取3个肿瘤细胞,利用Leica confocal software软 件计算荧光强度,实验重复3次取平均值。 1.4 Transwell小室法检测肿瘤细胞体外迁移能力
制作单细胞悬液(5×105/ml),30 μmol/L塞 来昔布或1 μmol/L PGE2加入单细胞悬液并混匀。 上室中加入200 μl药物与细胞的混悬液,下室加入 600 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液作为趋 化力,继续培养24 h后取出小室,拭去小室滤膜上 表面未穿出的细胞,瑞士染液染色20 min,倒置显 微镜200倍镜下分别选取滤膜下表面上、下、左、 右、中心5个视野计数,其平均细胞数进行统计分 析,各组设3个复孔。 1.5 统计学方法
计量资料结果以均数±标准差(x±s)表示, 采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理,多个样 本均数的比较采用单因素方差分析,两样本均数 的比较采用两独立样本t检验,两变量之间的相关 性检验用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有 统计学意义。 2 结果 2.1 实时荧光定量RT-PCR检测COX-2、 E-cadherin mRNA的表达量及相关性分析
塞来昔布按照10、20、30、40、50 μmol/L干 预SGC-7901细胞24 h后,COX-2 mRNA的表达量 与0 μmol/L组相比明显降低,其中20、30、40、 50 μmol/L浓度组与0 μmol/L组相比差异具有统计 学意义(P<0.01);而E-cadherin mRNA的表达 量则呈逐渐升高趋势,30、40 μmol/L两个浓度组 E-cadherin mRNA的表达量与0 μmol/L组相比差异 有统计学意义(P<0.01),且呈浓度依赖性增 高,见表1。塞来昔布30 μmol/L浓度处理SGC-7901 胃癌细胞12、24、36、48 h后,COX-2 mRNA的相对表达量降低,与0 h比差异有统计学意义(P<0.01); 相反的,E-cadherin mRNA的相对表达量逐渐升高, 36、48 h与0 h组相比差异有统计学意义(P<0.01), 见表2。PGE2按照0.1、1、5、10 μmol/L的浓度干预 SGC-7901细胞24 h,E-cadherin mRNA表达量逐渐下 降,分别为(0.68±0.02)、(0.48±0.007)、(0.24±0.03)、 (0.30±0.01),与0 μmol/L(1.00±0.00)相比 差 异 具 有 统 计学意义(P<0.05或P<0.01)。给予PGE21 μmol/L浓 度处理后,12、24、48 h E-cadherin mRNA表达量依次 为(0.65±0.03)、(0.54±0.11)、(0.57±0.13)与0 h组(1.00 ±0.00)相比 明 显 降 低,差异有统计学意义(P<0.05)。 采用曲线拟合描述COX-2与E-cadherin mRNA表达 的关系并进行差异性检验(P=0.04),说明COX-2与 E-cadherin mRNA表达之间呈负相关关系。
塞来昔布30 μmol/L作用24、36、48 h后E-cadherin 平均荧光强度分别为(23.94±5.66)、(53.14±11.49)、 (21.23±7.65),E-cadherin蛋白的表达量明显增加, 与对照组(14.54±3.13)相比差异均有统计学意义(P<0.05),见图1。PGE21 μmol/L处理SGC-7901细胞24、 48 h后,E-cadherin的平均荧光强度值分别为(16.1 ±0.43)、(10.3±0.8),其表达量明显降低,与对照组 (29.11±0.41)相比 差 异 均 有 统 计 学 意 义(P<0.05),见 图2。
A:control;B,C and D:fluorescence intensity of E-cadherin after treatment with Celecoxib for 24, 36 and 48 h
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A:control; B and C: fluorescence intensity of E-cadherin after treatment with PGE2for 24 and 48 h
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以30 μmol/L的塞来昔布作用于SGC-7901胃癌细 胞24 h后,计算穿膜细胞数为(15±5.9)个/高倍视野, 比对照组(75±12.3)个/高倍视野明显减少,差异有 统计学意义(t=16.196,P=0.000)。以1 μmol/L的PGE2 作用于体外培养的SGC-7901胃癌细胞24 h后,计算 穿膜细胞数为(120±16.78)个/高倍视野,比对照组 (75±12.3)个/高倍视野明显增加,差异有统计学意义 (t=-3.575,P=0.005)。 3 讨论
胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一,在中国每 年新增约36~40万胃癌患者,死亡率占据我国肿 瘤死因的第二位[ 6 ]。转移是恶性肿瘤最具破坏性 的特征,亦是导致恶性肿瘤死亡的首要因素,大 量研究证实,环氧合酶2(COX-2)在恶性肿瘤的 发生发展进程中发挥着重要的作用,因而其与恶 性肿瘤的关系倍受关注。目前认为,COX-2主要 通过催化花生四烯酸使前列腺素E2(PGE2)产生 增加而参与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移[ 7 ]。 E-cadherin是钙黏素家族的主要成员,在细胞-细胞 黏附中起重要作用,其功能缺失将破坏上皮细胞-细胞黏附功能,改变基质间的相互作用,转变细胞 迁移及信号使其具有癌细胞特征[ 2 ]。研究显示,肿 瘤进展阶段常伴有E-cadherin功能的缺失,使癌细 胞具有向临近组织侵袭及向远处转移的能力[ 8 ]。
大量研究发现COX-2与E-cadherin在消化道肿 瘤中存在调控关系。Bocca等[ 9 ]发现,罗非昔布能 够上调结肠癌细胞膜β-catenin/E-cadherin的表达 并抑制细胞增殖。Shar等[ 10 ]使用塞来昔布对29例 Barrett's 食管癌患者进行二级预防,随访一年后 发现与未干预组相比,干预组患者Barrett's 食管 癌明显好转,其分子标志物E-cadherin表达较对 照组升高。本研究显示:在体外实验中,塞来昔 布特异性抑制了SGC-7901胃癌细胞中COX-2的表 达,E-cadherin 表达量随着COX-2 表达下降呈剂量 和时间依赖性增高并出现明显的胞膜聚集现象,而肿瘤细胞迁移数量明显下降;另一方面,在加 入COX-2催化产物PGE2后E-cadherin表达明显下 调,肿瘤细胞迁移数量明显增加;统计学分析发 现COX-2与E-cadherin的表达水平呈负相关关系。 与我们的研究相似,Sitarz等[ 11 ]研究发现,COX-2 在传统的胃癌细胞系中上调E-cadherin转录及蛋白 的表达,在早发性胃癌细胞株中下调E-cadherin 的表达。上述结果均提示在SGC-7901细胞系中 E-cadherin的表达可能受COX-2的调控,COX-2抑 制剂的化学防癌机制可能与上调E-cadherin的表达 并进一步抑制肿瘤细胞迁移有关。但胃癌细胞中 COX-2调控E-cadherin 表达的信号转导通路尚需进 一步实验进行阐明。
本研究结果显示在体外实验中塞来昔布能 够抑制胃癌侵袭迁移并上调E-cadherin的表达; 而加入外源性的PGE2后促进胃癌细胞迁移并使 E-cadherin的表达下调。上述结果表明COX-2可能 通过调控E-cadherin参与肿瘤转移过程,提示非甾 体类消炎药(NSAIDs)的化学防癌机制可能与抑 制肿瘤细胞的迁移有关,为临床治疗胃癌提供了 新的思路和靶点。
[1] | Jemal A, Bray F, Center MM,et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin,2011,61(2): 69-90. |
[2] | Carneiro P,Fernandes MS,Figueiredo J,et al.E-cadherin dysf unction in gastric cancer-cellular consequences, clinical applications and open questions[J]. FEBS Lett,2012,586(18): 2981-9. |
[3] | Zheng X.The recent development of the relationship between cyclooxygenase-2 and gastric cancer[J].Xi Nan Jun Yi,2012,14(3):493-6.[郑旭.环氧化酶2(COX-2)与胃癌关系的 研究进展[J].西南军医,2012,14(3):493-6.] |
[4] | Almeida PR, Ferreira FV, Santos CC,et al.Immunoexpression of cyclooxygenase-2 in primary gastric carcinomas and lymph node metastases[J].World J Gastroenterol,2012,18(8): 778-84. |
[5] | Ford AC.Chemoprevention for gastric cancer[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2011,25(4-5): 581-92. |
[6] | KeXiang Z, YuMin L, Xun L,et al.Study on the association of COX-2 genetic polymorphisms with risk of gastric cancer in high incidence Hexi area of Gansu province in China[J].Mol Biol Rep,2011,38(1): 649-55. |
[7] | Thiel A, Mrena J,Ristim?ki A.Cyclooxygenase-2 and gastric cancer[J].Cancer Metastasis Rev,2011,30(3-4): 387-95. |
[8] | Corso G, Marrelli D, Roviello F. Familial gastric cancer and germline mutations of E-cadherin[J]. Ann Ital Chir, 2012,83(3): 177-82. |
[9] | Bocca C, Bozzo F, Ievolella M,et al.A novel nitro-oxy substituted analogue of rofecoxib reduces human colon cancer cell growth[J]. Mol Cell Biochem, 2012,361(1-2): 105-10. |
[10] | Shar AO, Gaudard MA, Heath EI,et al.Modeling using baseline characteristics in a small multicenter clinical trial for Barrett's esophagus[J]. Contemp Clin Trials,2009,30(1): 2-7. |
[11] | Sitarz R, Leguit RJ,de Leng WW,et al.Cyclooxygenase-2 mediated regulation of E-cadherin occurs in conventional but not earlyonset gastric cancer cell lines[J].Cell Oncol,2009,31(6): 475-85. |