甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占内分泌系统肿瘤的90%以上^{[ 1 ]}，甲状腺癌治疗失败的主要原因在于发生侵袭与转移。

转移是具有非随机性、有组织器官选择性的 高度组织化过程，Müller等^{[ 2 ]}提出靶器官趋化因子及肿瘤细胞中受体的表达在决定肿瘤细胞转移部 位上起着关键作用。CCR7为CC族趋化因子受体， 通常表达于免疫细胞、内皮细胞的细胞膜上，其 配体SLC分布于外周免疫器官或组织，尤其是淋 巴结的T细胞区，对多种免疫细胞有趋化作用。目 前研究发现，CCR7在胃癌^{[ 3 ]}、乳腺癌^{[ 4, 5, 6 ]}、甲状腺 癌^{[ 7 ]}中均高表达,且与淋巴结转移密切相关。D2-40 是一种单克隆抗体，能识别存在于淋巴内皮、胎 盘组织、睾丸生殖细胞肿瘤中的O-连接的唾液酸 糖蛋白^{[ 8 ]}，可以与淋巴管内皮反应，但不与血管内 皮反应，用于标记肿瘤组织中的淋巴管内皮，有 助于判断肿瘤组织微淋巴管形成，癌细胞是否发 生浸润和转移。文献报道^{[ 9, 10, 11, 12, 13 ]}，在肺癌、乳腺癌等 肿瘤中D2-40表达与淋巴结转移、远处转移、肿瘤 分化程度、临床分期等呈正相关。但未见CCR7和 D-40在甲状腺癌中的表达，本课题拟研究两者在 甲状腺癌中的表达情况及与淋巴转移的关系。 1 资料与方法 1.1 临床资料

因滤泡状癌、髓样癌和未分化癌组织标本收 集困难，87例甲状腺癌病例分别来自2003年1月至 2010年12月间在云南省肿瘤医院、云南省第一人民 医院、昆明医科大学第一附属医院、昆明市第一人 民医院、昆明市延安医院行手术治疗的患者，所有 病例均有完整的病史资料及完整的组织切片和存 档蜡块。上述标本均由各医院病理科副主任资质 以上医师复片并明确诊断。20例正常甲状腺组织 由昆明医科大学法医学院提供。87例甲状腺癌按 中国肿瘤病理学分类标准分为：乳头状癌40例，髓 样癌20例，滤泡癌15例，未分化癌12例。有淋巴结 转移49例，无淋巴结转移38例。所有患者术前均未 行化疗、放疗及肿瘤相关治疗。年龄最大76岁，最 小12岁，平均年龄（44.35±8.50）岁。男35例，女 52例。按美国国家综合癌症网（NCCN）2011年新 修订的甲状腺癌肿瘤TNM分期分为：Ⅰ期28例； Ⅱ期14例；Ⅲ期20例，Ⅳ期25例。所有组织标本均 经10%的福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连 续切片，免疫组织化学染色。 1.2 免疫组织化学试剂

鼠抗人CCR7单克隆抗体（R&D公司)；即用 型鼠抗人D2-40单克隆抗体（福州迈新生物工程公 司）；即用型快捷免疫组织化学MaxVision 检测试 剂盒（福州迈新生物工程公司）；DAB显色试剂 盒(丹麦Dako公司)。 1.3 免疫组织化学染色（Max Vision法）

CCR7与D2-40均选用柠檬酸盐缓冲液 （pH=6.0）高温高压抗原修复法对常规组织切片 进行抗原修复，采用Max Vision快捷免疫组织化学 染色，严格按照试剂盒操作说明进行，CCR7稀释 度为1∶700，已知CCR7阳性组织及淋巴管瘤切片 分别作CCR7及D2-40阳性对照，PBS取代一抗作阴 性对照，DAB显色，苏木精对比染色。 1.4 结果判定 1.4.1 CCR7结果判定

由两位病理医师分别双盲 阅片。CCR7的结果判定按照Andre等的方法，细 胞质和(或)细胞核膜出现棕黄色颗粒为阳性染色。 根据阳性细胞染色强度及阳性细胞在总细胞中比 例来判定结果。无阳性细胞为0分；<10%为1分； 10%～50%为2分，≥50%为3分，按染色强度评分： 无着色为0分；轻度着色(浅黄色) 为1分；中度着色 (棕黄色)2分；重度着色(棕褐色)为3分。两者评分 之和<3分为阴性(-)，≥3分为阳性(+) 。 1.4.2 D2-40结果判定

根据Combos等方法: D2-40 表达定位于淋巴管内皮细胞，呈棕黄色或棕褐色颗 粒。先在低倍镜(×100)下观察甲状腺癌瘤内区、瘤 周区及正常组织阳性染色最丰富区(hot spots)，再在 高倍镜(×400)下分别计数淋巴管数，每个阳性染色 的内皮细胞、内皮细胞簇或单个微小脉管均计为1 个微淋巴管。每例各计数3个视野，记录其平均值。 1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件对上述实验所得数据 进行比较分析，D2-40标记的MLVD计数为计量 资料，采用均数±标准差（x±s）表示，两组间资 料分别采用两独立样本t检验；多组资料采用单向 方差检验，组内存在差异则采用LSD进行两两比 较。CCR7计数资料采用R×C列表及2×2列表的χ²检 验。MLVD与CCR7、各临床病理资料的相关性采 用Spearman相关分析；检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 甲状腺癌组织及正常甲状腺组织中CCR7的表达

CCR7在正常甲状腺组织及甲状腺癌组织中 均表达阳性。两者从染色强度相比,正常甲状腺 组织染色多为阴性未染色或呈浅黄色，染色面积 相对小，见图1。正常甲状腺组织CCR7阳性率为 15%(3/20),甲状腺癌CCR7阳性率为66.7%(58/87)。

A:papillary thyroid carcinoma; B: medullary thyroid carcinoma;C: follicular thyroid carcinoma;D: undifferentiated thyroid carcinoma 图1 CCR7在甲状腺癌组织中的表达（IHC ×400） Figure 1 CCR7 expression in thyroid carcinoma tissues（IHC ×400）

甲状腺癌组织中CCR7表达在年龄、T分期 (肿瘤大小)间差异无统计学意义(P>0.05)；乳头状 癌、髓样癌、滤泡癌、未分化癌CCR7阳性率分别 为75.0%、70.0%、73.0%、25.0%，差异有统计学 意义（P<0.05）；淋巴结阳性组[81.6%（40⁄49）] 高于淋巴结阴性组[47.4%（18⁄38）]，差异具有统 计学意义（P<0.05），见表1。

表1(Table 1)

表1 甲状腺癌组织中CCR7、D2-40与临床病理特征的关系 Table 1 Relationship of CCR7, D2-40 expression and clinicopathological parameters in thyroid carcinoma tissues

表1 甲状腺癌组织中CCR7、D2-40与临床病理特征的关系 Table 1 Relationship of CCR7, D2-40 expression and clinicopathological parameters in thyroid carcinoma tissues

D2-40定位于微淋巴内皮细胞的胞膜与胞质 内。标记的淋巴管呈棕黄色为阳性。肿瘤中间淋 巴管多呈闭塞状态，瘤周淋巴管呈扩张状态，见 图2。甲状腺癌与正常甲状腺组织的微淋巴管均可 见D2-40阳性表达。周边部分可见未被染色的微血 管结构，内可见红细胞分布。

A: papillary thyroid carcinoma; B: medullary thyroid carcinoma; C: follicular thyroid carcinoma; D: undifferentiated thyroid carcinoma; E: medullary thyroid carcinoma; F: peripheral follicular thyroid carcinoma 图2 甲状腺癌组织中 D2-40标记的淋巴微管（ IHC ×400） Figure 2 MLV in thyroid carcinoma tissues makerd by D2-40（IHC ×400）

D2-40主要标记于甲状腺癌瘤周的淋巴管上 皮，阳性部位为细胞膜和细胞质；而瘤间质内的 淋巴管很少表达。甲状腺癌与正常甲状腺组织的 MLVD计数分别为5.72±2.89、2.60±1.14，甲状腺癌 中MLVD明显增高(P<0.05)。 2.4 甲状腺癌组织不同临床病理参数中D2-40标记 MLVD的情况

甲状腺癌组织中D2-40标记的MLVD在患者的 年龄、T分期间差异无统计学意义(P>0.05),在病理 类型间差异有统计学意义(P<0.05),乳头状癌与髓 样癌、滤泡癌、未分化癌比较差异有统计学意义 (P=0.001,P<0.05)，髓样癌与滤泡癌比较差异无统 计学意义(P＝0.109),髓样癌与未分化癌比较差异 有统计学意义(P=0.001)，滤泡癌与未分化癌比较 差异有统计学意义(P＝0.035)。在淋巴结转移阳性 和阴性组间进行比较，MLVD差异具有显著统计学 意义(P<0.05)。 2.5 甲状腺癌中D2-40标记的MLVD、CCR7、临 床病理参数之间的关系

D2-40标记的CCR7阳性组MLVD(9.37±2.25)高 于阴性组(5.51±2.47)，两者比较差异具有统计学意 义(P<0.05)。D2-40标记的MLVD与CCR7表达呈正 相关(rs=0.645，P ＝0.018，P<0.001)。 D2-40标记的MLVD 与年龄、T分期无关(P＞ 0.05);与病理类型、淋巴结转移相关(P＜0.05)。 3 讨论

肿瘤细胞表面CCR7与淋巴结T细胞区CCL21结 合，导致沿淋巴结发生运动浸润继而转移到远处。 国外也有文献报道^{[ 14 ]}肿瘤细胞表面自分泌CCR7受 体高表达与肿瘤自身分泌的配体(CCL19/CCL21)和 （或）免疫细胞(T细胞)分泌的配体(CCL19/CCL21) 结合后趋化肿瘤细胞向淋巴结方向移动，此过程中 有许多生长因子如VEGF-C、D及受体VEGFR-3、 bFGF和相关酶等调控。国内文献报道^{[ 15 ]}子宫颈癌 CCR7阳性表达率与肿瘤淋巴管增生、扩张、肿瘤淋 巴转移密切相关。肺癌 ^{[ 16, 17, 18, 19 ]}、大肠癌 ^{[ 20 ]}、胰腺癌 ^{[ 21 ]}、 宫颈癌^{[ 15 ]}等，原发肿瘤组织中CCR7的表达、肿瘤 淋巴管生成与肿瘤淋巴结转移呈正相关。

CCR7高表达于某些肿瘤细胞，其配体SLC21 在淋巴结、非淋巴组织的内皮淋巴导管、T细胞区 等。肿瘤细胞表面CCR7与淋巴结T细胞区CCL21 结合，引起细胞内机动蛋白的聚合，其聚合与肿 瘤细胞伪足形成有关，伪足是肿瘤细胞浸润、转 移必备条件，导致沿淋巴结发生运动浸润继而转 移到远处。在胃癌、大肠癌、乳腺癌等多种肿瘤 标本中均证明CCR7/CCL21的相互作用与肿瘤的淋 巴转移和预后呈正相关^{[ 22, 23, 24 ]}。

肿瘤淋巴转移中必要环节为肿瘤淋巴管的生 成，D2-40是近年发现的淋巴管标记物，一种单 克隆抗体，D2-40标记淋巴管特异性较强，灵敏度 高，能够很好区别微血管与微淋巴管，目前被认 为是最具特异性的淋巴管标记物^{[ 25 ]}，被广泛运用 在肿瘤淋巴管与肿瘤生物学关系的研究。D2-40作 为最具特异性的淋巴管内皮细胞标记物，能特异 性监测肿瘤组织内新生淋巴管数目，在实验研究中常用于估算微淋巴管密度。

甲状腺癌易侵犯淋巴管,转移至颈部淋巴结， 淋巴结转移率高达72%，不同的病理类型转移情况 不同，其中乳头状癌淋巴结转移最常见，髓样癌及 滤泡癌淋巴结转移较少见，未分化癌几乎不发生 淋巴结转移。本实验研究结果显示：甲状腺癌淋 巴结转移组中CCR7阳性率与D2-40标记的MLVD高 于无淋巴结转移组，CCR7、D2-40标记的MLVD与 淋巴结转移呈正相关；在甲状腺癌中，CCR7阳性 组D2-40标记的MLVD高于CCR7阴性组D2-40标记 的MLVD；甲状腺癌不同病理类型中CCR7和D2-40 标记的MLVD差异有统计学意义。研究结果与甲状 腺癌的临床表现相符：乳头状癌淋巴结转移常见 （CCR7阳性率与D2-40标记的MLVD均高），未分 化癌几乎不发生淋巴结转移（CCR7阳性率与D2-40 标记的MLVD均低）。笔者前期研究结果表明：非 小细胞肺癌及乳腺癌的淋巴结转移与肿瘤细胞高表 达CCR7密切相关^{[ 26 ]}，通过检查乳腺癌组织（粗针 活检），肺癌组织（纤支镜取材）预测淋巴结转移 有较高的敏感度及准确性。本课题对甲状腺癌进行 的研究得出了相同的结果。云南省地处边疆，各地 治疗水平差异较大，一些甲状腺癌患者仅进行单纯 甲状腺包块切除，本研究将患者外院的病理组织进 行CCR7和D2-40检测，同时联合影像检查结果更 准确评估患者淋巴结状态，有利于个体化制定手术 方案，减少不必要的淋巴结清扫。但本研究未分化 癌例数少，以后将继续收集组织标本进行研究。

本研究结果亦表明：D2-40对淋巴内皮细胞具 有敏感度及特异性，能清楚标记出肿瘤淋巴管， 区分淋巴管与血管，且肿瘤淋巴管主要分布于瘤 周，今后可将其运用于肿瘤淋巴管的研究。

肿瘤细胞表达CCR7与配体结合形成CCR7/ CCL19/CCL21系统，趋化肿瘤细胞向淋巴结移 动。同时CCR7上调VEGF-C、VEGF-D表达，使 得肿瘤淋巴管增生形成，为肿瘤淋巴转移埋下伏 笔。CCR7趋化参与VEGF-C促进肿瘤血管内皮及 淋巴管内皮新生，VEGF-C协同CCR7抗肿瘤细胞 凋亡及肿瘤细胞趋向淋巴组织及淋巴管。D2-40标 记的MLVD增高为肿瘤进一步扩散、淋巴转移、远 处转移提供更多可能性。D2-40、CCR7联合监测 可作为评估甲状腺癌淋巴结转移潜能的标志物， 能更准确、高效预测肿瘤转移，预测预后及生存期。进一步认识甲状腺癌淋巴结转移的发生机制, 为临床诊断和预后判断提供新的理论依据，为甲 状腺癌的治疗提供新的线索和途径。