马齿苋科植物马齿苋（Portulaca oleracea L）， 广泛分布全球温带和热带地区，为药食两用植 物，其地上部分为中药马齿苋来源，具有清热解 毒、凉血消肿之功效，临床可用于防治大肠癌、 腹泻、痢疾、尿路感染等多种疾病。马齿苋所含 化学成分包括黄酮类、萜类、香豆素类、生物碱 类、挥发油类和多糖等，其粗提物或有效部位具有 抗肿瘤、保肝、抗菌、抗缺氧、抗氧化、抗病毒、 心律失常、调血脂、降血糖等多种药理作用^{[ 1 ]}。李 玉萍等^{[ 2 ]}通过体外筛选发现，马齿苋总生物碱明 显抑制HeLa细胞增殖，体内试验则显著抑制荷 瘤（S180）小鼠瘤体重量。然而，到目前为止并 没有任何关于马齿苋单体化合物抗宫颈癌的体内 外研究报道，这对进一步深入阐明马齿苋确切的 抗癌作用机制和新药研发具有重要意义。我们先前对马齿苋药材的质量等进行了研究^{[ 3 ]}，并从中 分离得到一个新的脑苷脂类化合物马齿苋脑苷A （portulacerebroside A,PCA）。本研究旨在探讨 PCA对宫颈癌HeLa细胞是否具有诱导凋亡和抑制 其侵袭转移的作用，以初步评价其临床应用价值。 1 材料与方法 1.1 实验材料

HeLa细胞(南京凯基生物科技发展有限公司)， 磷酸缓冲液（PBS，Hyclone，美国），胎牛血清 （FBS，Hyclone，美国），DMEM细胞培养液、 二甲基亚砜（DMSO）、四甲基噻唑盐（MTT）和 0.25%胰酶（Trypsin）（Sigma，美国），链霉素、 青霉素双抗液（碧云天生物研究所，中国）。 1.2 马齿苋脑苷A的制备

马齿苋脑苷A参照文献方法制备^{[ 3 ]}，纯度 98.1%。实验前用DMSO溶解（终浓度<0.5%）， 再用培养液稀释至所需浓度。 1.3 细胞培养

HeLa细胞在含体积分数10%胎牛血清，1% 链霉素、青霉素双抗液的DMEM细胞培养液中 37℃、5%的CO2和饱和湿度条件下传代培养，每2 天换培养液1次，细胞生长成片，相互融合铺满瓶 底约80%时进行传代。 1.4 细胞活力

取对数生长期HeLa细胞，0.25%不含EDTA胰 酶消化，加入新鲜培养液吹打，调整细胞浓度2×10⁴/ml，100 μl/孔接种于96孔板中，在5%CO2、 37℃的细胞培养箱内培养12 h，至细胞铺满板底 80%时弃去培养液，加入含不同浓度PCA的培养 液，每个浓度做6个复孔，分别于12 h和24 h两个 不同时间点进行MTT活性检测。每个时间点检测 前再加入0.5%的MTT液20 微升/孔，继续培养4 h 后弃上清液，加入150 μl的DMSO，振荡10 min。 在570 nm检测波长下，自动酶联免疫分析仪测定 吸光度值（OD）。 1.5 凋亡率检测

将HeLa细胞以1×10⁶个/ml的浓度分别接种于 6孔板中，每孔2 ml。DMEM培养液培养12 h后， 加入不同浓度的PCA继续培养12 h。0.25%胰酶消 化，吸弃胰酶，加入培养液终止，用1 ml枪头轻轻 吹打，至细胞成悬浮状。将细胞悬浮液转移至离 心管中，以2 000 r/min离心5 min，弃培养液。PBS 缓冲液洗涤1~2次，2 000 r/min收集细胞，500 μl Binding Buffer 悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC 混匀，再加入5 μl Propidium Iodide混匀，室温避光 反应10 min。使用流式细胞仪(FACSCalibur,Becton Dickson,美国)检测细胞凋亡率。 1.6 细胞迁移实验

采用划痕试验法观察PCA对细胞迁移能力的 影响。将HeLa细胞以1×10⁶个/ml接种于6孔板，每 孔2 ml。待细胞覆盖率达到95%时，用10 μl无菌 枪头在孔中央划十字交叉线，PBS洗3次。改用含 不同浓度的PCA培养液（含0.5%胎牛血清）培养 12 h。弃去培养液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，倒置显微镜（CKX41，Olympus，日本）下 观察十字交叉中心附近，随机选5个视野记录细胞 数，以空白组为对照，计算迁移百分比。 1.7 细胞黏附实验

将基质胶(Sigma，美国)30 μl加入96孔培养板 中，干燥1 h后，37℃的PBS液小心冲洗2次，每孔 加入含1%胎牛血清的PBS 100 μl，培养箱中孵育1 h，再以PBS液200 μl冲洗两次。将经不同浓度PCA 预处理12 h的HeLa细胞用无血清DMEM培养液制 成5×10⁵个/ml细胞悬液，加入96孔培养板中，每 孔100 μl，培养箱中孵育0.5、1、1.5 h。培养结束 后，缓慢吸出培养液，PBS小心冲洗未黏附的细胞 2次，加入含2%胎牛血清的DMEM培养液200 μl， MTT法测定OD值。试验同时设含10%胎牛血清培 养的空白对照，以各无血清组OD值/含血清空白组 OD值计算黏附百分率。 1.8 细胞侵袭试验

细胞体外侵袭试验采用Transwell小室进行。 将HeLa细胞用不同浓度PCA预处理12 h，胰酶消化 后配制成5×10⁵个/ml的单细胞悬液，加入侵袭小室 上层，每孔100 μl，下方小室放置500 μl含20%FBS 的DMEM培养液，37℃下孵育8 h后，取出小室， 用湿润棉签擦去底部的基质胶和细胞，甲醛固定 10 min，常规HE染色后于200倍光学显微镜下计数 膜背面侵袭的细胞数，计数中间和四周5个视野， 计算平均数。 1.9 统计学方法

采用SPSS15.0统计学软件进行数据分析，数 据以x±s表示。多组间比较采用方差分析和两组之 间t检验。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 对细胞活力的影响

本实验考察了7个不同给药浓度（1.5、3、6、 9、12、15和18 μg/ml）和2个不同时间点（12 h和24 h）PCA对HeLa细胞活力的影响。给药浓度等 于或高于6 μg/ml时，细胞活力被显著抑制，且随 给药时间的延长抑制作用愈加明显，与空白组比 较差异有统计学意义（P<0.05或0.01），见图1。

*:P<0.05 vs.control group, **:P<0.01 vs. control group 图1 马齿苋脑苷A作用12 h(A)和24 h(B)后对HeLa细胞活力的影响 Figure 1 Effects of PCA on viability of HeLa cells after treatment for 12 h(A) and 24 h(B)

流式细胞仪凋亡检测结果显示，正常空白组 凋亡率为仅8.2%（右上限+右下限）。但给予PCA （6、9、12 μg/ml）处理12 h后，HeLa细胞凋亡率 显著升高，3个浓度组分别为20.63%、51.27%和 67.32%，且呈剂量依赖关系，见图2。

图2 马齿苋脑苷A作用12 h后对HeLa细胞凋亡率的影响 Figure 2 Effects of PCA on apoptosis of HeLa cells after treatment for 12 h

划痕实验结果显示，经PCA处理12 h后HeLa细 胞迁移能力显著降低，与空白组比较，细胞迁移数 量显著减少，迁移百分率显著降低，差异有统计学 意义（P均<0.01），且呈剂量依赖性，见图3。

**:P<0.01 vs.control group 图3 马齿苋脑苷A作用12 h后对HeLa细胞迁移的影响 Figure 3 Effects of PCA on migration of HeLa cells after treatment for 12 h

实验考察了PCA4个剂量作用12 h后在0.5、1、 1.5 h对HeLa细胞黏附率的影响，见图4。结果发现， 除1.5 μg/ml剂量0.5 h和1 h外，其余各组在3个时间 点均显著降低细胞黏附百分率（与空白组比较，P 均<0.01），提示其明显的抑制细胞黏附能力。

**, ΔΔ, ††: P<0.01 vs.corresponding control groups 图4 马齿苋脑苷A作用不同时间后对HeLa细胞黏附百分 率的影响 Figure 4Effects of PCA on adhesion rate of HeLa cells after treatment for different time

细胞在一定时间内穿过基质胶的数量可反映 其侵袭能力。本实验结果显示不同浓度PCA预 处理12 h后，HeLa细胞穿过基质胶的数目显著 降低，与空白组比较差异有统计学意义（P均< 0.01），见图5。

**: P<0.01 vs.control group 图5 马齿苋脑苷A作用12 h后对HeLa细胞穿膜细胞数的影 响 Figure 5 Effects of PCA on invasion number of HeLa cells after treatment for 12 h

癌症引起人体死亡不仅涉及肿瘤细胞恶性增 殖，更与其侵袭转移密切相关，理想的治疗药物 应既能抑制肿瘤细胞增殖，又能阻止其侵袭和转 移。已有一些中药单体成分被报道同时具有这两 方面的作用，如50~600 μM浓度的白藜芦醇可抑制 宫颈癌细胞（SiHa、HeLa和C33A）增殖和诱导凋 亡^{[ 4 ]}，250~1 000 μM浓度则减少Transwell侵袭试验 中HeLa细胞小室底膜穿过数^{[ 5 ]}。10、20、40 μM浓 度的三氧化二砷（As₂O₃）可通过增加活性氧和降 低线粒体膜电位诱导宫颈癌细胞（HeLa）凋亡 ^{[ 6 ]}， 5 μM浓度抑制宫颈癌细胞(HeLa,SiHa,Caski)的黏 附、侵袭和迁移^{[ 7 ]}。然而，同时具有这两方面作用 的中药单体化合物并不多，而且这些化合物不是使用剂量较大就是对人体具有剧烈的毒性，难以 进一步在临床推广应用。

马齿苋苷A为我们首次从中药马齿苋中分离 得到脑苷脂类的新化合物，经采用经典的体外实 验方法，包括MTT法、流式细胞凋亡检测、划痕 试验、Transwell法和黏附试验等实验证实，PCA 较低剂量即能显著诱导HeLa细胞凋亡，明显抑制 其侵袭和转移，提示其良好的抗宫颈癌作用。然 而，PCA诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡和抑制其侵袭 转移的分子作用机制尚需进一步研究。