原发性肝细胞癌( hepatocellular carcinoma, HCC) 是最常见的恶性肿瘤之一。研究表明乙型肝 炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因(HBx)编码的 X蛋白与HCC的发生、发展密切相关^{[ 1 ]}。HBx具有 多种生物学功能，如参与病毒的复制、反式激活多种病毒和细胞基因、通过影响正常细胞周期干扰 DNA的修复及调节肝细胞增殖、分化和凋亡等， 但具体的致癌机制尚未明确^{[ 2 ]}。p53蛋白可通过其 下游转录产物p21影响细胞的凋亡与周期，认为与 多种肿瘤的发病密切相关。本研究首先建立稳定 转染X基因及空载体的HepG2细胞株，分别记为 HepG2X及HepG2X₀，其次通过HBx与p53-p21途径 的作用关系来验证其对肝癌细胞癌变机制的影响。 1 材料与方法 1. 1 实验材料

　 细胞株及真核载体：肝癌HepG2细胞株购自湘 雅医学院细胞中心；真核表达载体PCDNA3.1(+)－ X由本实验室构建^{[ 3 ]}；小牛血清RPMI1640培养液购 自Gibco公司；Lipofectamine2000和G418均购自武 汉晶美生物工程有限公司；HBx单克隆抗体购自 Abcam公司；辣根酶标记羊抗鼠IgG、鼠抗人P53 单抗购自北京中杉金桥生物公司；Anti-β-actin购 自北京BIOS公司；Trizol 试剂购自上海生工；RTPCR试剂盒购自Ferments公司；p21引物由上海生 工合成；流式细胞检测送北京鼎国生物公司检测。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养

人肝癌细胞株HepG2细胞培养 于含10%小牛血清的DMEM100 ml培养瓶中。内 含青霉素100 u/ml、链霉素100 mg/L。待细胞生 长呈单层铺满瓶底时，用0.25%的胰蛋白酶(含 0.02%EDTA) 消化传代。 1.2.2　基因转染

　将真核表达载体pCDNA3.1-X及 空载体pCDNA3.1 2 μg与脂质体10 μl混合，转染入 对数生长早期的HepG2细胞。用含400 μg/ml致死 量的G418的培养液筛选2周，极少数存活细胞继续 在37℃、5%CO2 、饱和湿度下培养3周，并用含 200 μg/ml半致死量G418的培养液加以维持，逐渐 形成细胞克隆。小心用细胞刮刀刮取10个细胞克 隆，分别转移至10个25 ml的小培养瓶中，用胰酶 消化吹打成单细胞悬液，继续用半致死量的G418 培养液培养，约一周后长满培养瓶。 1.2.3 Western blot检测X蛋白在HepG2X细胞株中 的表达

用含10%胎牛血清(FCS)的DMEM培养液 清洗，再加入含10%FCS的DMEM，离心收集各 转染组及空质粒组细胞，取100 μl细胞裂解液（含 PMSF10 μl）充分裂解细胞。15%SDS/PAGE电泳 后电转移至硝酸纤维膜上,经过5%脱脂奶粉封闭。 首先与一抗(鼠抗人Anti-HBx，1:1 000稀释)温育 2 h，充分洗涤后,再与二抗（羊抗鼠，1:10 000稀 释）室温孵育2 h，DAB显色。 1.2.4 转染细胞的细胞生物学检测 1.2.4.1 转染细胞生长曲线测定

HepG2、空质粒 组及转染细胞制成单细胞悬液,按每孔3×10³个细胞 的密度接种于24孔板，细胞计数连续7 d。每组实 验均重复3次，取均数进行生长曲线的绘制。 1.2.4.2 平板克隆形成实验

消化对数期生长的细 胞，按每孔1 000个细胞的密度接种于6孔板，移入 CO2孵箱培养2周。甲醇固定,姬姆萨染液染色。计 数大于50个细胞的克隆数,按下面公式计算：克隆 形成率(%) =克隆数/接种细胞数×100%。各组实验 均重复3次。 1.2.5 细胞周期和细胞凋亡检测

消化对数期生 长的细胞,PBS充分洗后,收集1 ×10⁶细胞经乙醇固 定,加碘化丙啶,经流式细胞仪检测细胞周期；细胞 凋亡检测取1×10⁵细胞按试剂盒说明进行,依次加入 碘化丙啶，上流式细胞仪检测，同时采用无血清 诱导24 h检测各转染组细胞凋亡状态。 1.2.6 Western blot检测p53蛋白

用Western blot 分别检测HepG2、空质粒组及转染组p53蛋白的表 达，p53蛋白检测方法同X蛋白检测。一抗1:400稀 释，二抗1∶10 000稀释。 1.2.7 RT-PCR检测p21mRNA水平

Trizol试剂提 取细胞总RNA，操作按说明书进行。采用随机引 物方法进行反转录，PCR进行cDNA 扩增。PCR 引 物序列：上游引物：5'-AGGTGAGGGGACTCCA AAGT-3';下游引物：5'-TGCCTACAGCCTCCTAA TAC-3’。反应条件:94℃，5 min; 94℃2 min,56℃ 2 min,72℃1 min，共30 个循环;最后72℃延伸5 min。扩增片断大小: 200 bp左右。β-actin引物序列: 上游引物5'-AGCGAGCATCCCCAAAGTT-3’；下 游引物5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，扩增 条件同上。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳,紫外 分析仪观察结果，凝胶成像系统照相。 1.3 统计学方法

应用SPSS15.0软件进行统计学分析，数据采用 student T检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1 基因转染

转染pcDNA3.1(+)-X株(即HepG2X细胞株)及转 染空载体的HepG2细胞(即HepG2X₀细胞株)经G418 筛选后，两周后形成细胞克隆，见图1，而未转染 的细胞株死亡。HepG2X₀及HepG2X细胞均形成细 胞克隆，但后者凋亡小体明显增多。

A: HepG2X0cell clone;B:HepG2X cell clone 图1 G418筛选细胞克隆图(×400) Figure 1 Cell clone selected by G418(×400)

在转染了X基因的10个HepG2X细胞克隆中，X 蛋白仅在1个克隆中有表达,蛋白表达于约21 kD处, 见图2。说明X基因已成功转染入HepG2细胞株。

1:HepG2;2:HepG2X;3:HepG2X0;4:prestained marker 图2 Western blot检测X蛋白表达 Figure 2 X protein expression detected by Western blot

HepG2X细胞株较 其他两株细胞生长快，倍增时间缩短，而其他两 株细胞基本一致，见图3 。

图3 HepG2、HepG2X0、及HepG2X三株细胞生长曲线图 Figure 3 Cells growth curves of HepG2, HepG2X0and HepG2X stains

基因（HepG2）、转染空载体(HepG2X₀)及稳定表 达X蛋白（HepG2X）的肝癌细胞亲本细胞各2 000 个/皿,接种于培养皿,培养2周后可见细胞集落形 成,姬姆萨染色，计算克隆形成率,分别为69.6%, 39.9%和42.0%，见图4。T检验显示，HepG2X细胞 株形成率较其他两株细胞高，并且差异有统计学 意义(P<0.05) ,HepG2X₀克隆形成率与HepG2细胞 克隆形成率相近,差异无统计学意义(P>0.05)。

A:HepG2 and HepG2X0 plate clone formatting experiment; B:HepG2X plate clone formatting experiment 图4 平板克隆形成试验检验HepG2、HepG2X0、 HepG2X三株细胞系单克隆形成能力 Figure 4 Plate clone formatting experiments inspect the monoclonal formation ability of HepG2、HepG2X0 and HepG2X

HepG2、HepG2X₀及HepG2X细胞的凋亡率依次为 1.23%、5.07%及13.0%，表明HepG2X细胞比其他 两株细胞的凋亡明显增加，见图5。

A:untreated HepG2 cell apoptosis;B:HepG2X0cell apoptosis;C:HepG2X cell apoptosis 图5 流式细胞仪检测转染后HepG2、HepG2X0和HepG2X细胞的凋亡水平 Figure 5 HepG2，HepG2X0and HepG2X cell apoptosis after transfection detected by flow cytometry

以上三株细胞在53 kD处均见蛋白表达，三 次上样的HepG2X细胞中P53表达均强于HepG2及 HepG2X₀细胞(P<0.0001)。而后两株细胞P53蛋白 表达未见明显差异，见图6。

图6 HepG2X、HepG2X0及HepG2细胞中P53蛋白 Western blot检测 Figure 6 p53 protein expression in HepG2X, HepG2X0and HepG2 detected by Western blot

约200 bp处可见p21mRNA的PCR产物片段， HepG2X较其他两组细胞p21mRNA水平明显减 低，见图7。

图7 RT-PCR检测HepG2、HepG2X及HepG2X0细胞中 p21mRNA的表达 Figure 7 p21mRNA expression in HepG2, HepG2X and HepG2X0detected by RT-PCR

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生 与发展与HBV感染密切相关，特别是HBx基因编 码的X蛋白具有反式激活作用，可激活病毒和细胞 基因，调控其转录，与病毒复制和慢性感染状态的 维持相关，在HCC的发生发展过程中具有重要作 用^{[ 4 ]}。为研究X蛋白对肝癌细胞恶性表型的影响， 本研究将HBx基因真核表达载体PCDNA3.1-X及空 载体PCDNA3.1用脂质体介导法分别转入肝癌细胞 HepG2，并经G418筛选获得稳定表达X蛋白的肝癌 细胞克隆株HepG2X及HepG2X₀。Western blot证实 X蛋白能在转染株HepG2X中表达，而在对照组细 胞中不表达。有研究^{[ 5 ]}表明，HBx蛋白有促进与抑 制凋亡的双重作用，这与本研究的结果一致。细 胞生长实验表明HepG2X株生长的倍增时间明显短于HepG2及HepG2X₀细胞株，克隆形成率亦高于对 照组亲本细胞，表明稳定表达X蛋白的肝癌细胞恶 性表型增高，有抑制凋亡的作用。但流式细胞结 果显示，转染株HepG2X比只转染空载体HepG2及 HepG2细胞株凋亡率明显增加，细胞周期结果显示 HepG2X细胞G2/G1比值增加，表明转染组的增殖期 细胞增多，细胞DNA合成旺盛。形态学上转染株 细胞生长力旺盛、分裂相极多见，凋亡小体明显增 多，表明HBx蛋白同样具有促进凋亡作用，使肝癌 细胞恶性表型增加。大量研究表明，HBx参与细胞 凋亡的具体机制可能与p53-p21调节途径有关^{[ 6, 7, 8 ]}。

p53基因定位于17p13.1，编码具有蛋白质-蛋 白质结合功能的p53蛋白。该基因及其表达产物 分为野生型与突变型两种。含野生型p53的细胞在 DNA受到损伤时可使细胞停止于G1期以修复损伤 的DNA，从而抑制凋亡的发生。HBxAg与p53可 以结合形成复合物的形式使p53蛋白在细胞内积聚 的现象也见于Kwun等^{[ 7 ]}及Mathonnet等^{[ 8 ]}的研究结 果，而本研究表明稳定转染X基因的HepG2细胞株 后p53蛋白表达明显高于未转染的HepG2细胞株， 两者研究结果一致。HBx与p53 结合后，可导致 p53基因的突变而失活，从而使后者正常的抑制凋 亡的活性下降。Western blot结果显示，HepG2X细 胞p53含量比HepG2及转染空载体的HepG2细胞株 增加。p53基因可与细胞内的转录因子p21结合，起到活化与调节作用^{[ 9 ]}。p21作为p53基因的下游 转录激活产物，具有抑制细胞周期素/细胞周期 依赖性激酶的作用，导致G1期阻滞，以修复损伤 的DNA ^{[ 10 ]}。由于p53的失活，其活化p21的功能减 退。RT-PCR结果表明HepG2X细胞中p21 mRNA水 平减低，从而使p53通过p21来修复损伤的DNA途 径进一步受阻，最终导致细胞的恶性表型增加。 但X基因与p53-p21途径具体的信号转导机制仍有 待进一步研究。