组织因子途径抑制物2(TFPI-2)属于Kunitz 型 丝氨酸蛋白酶抑制物超家族蛋白，是近年来发现 的一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制物，可以抑制 多种恶性肿瘤的生长、血管生成、浸润及转移。 近年来研究发现在常见的恶性肿瘤包括肺癌， TFPI-2基因启动子区甲基化使TFPI-2表达下降或 者缺失，这与肿瘤的生长、浸润及转移有关^{[ 1, 2, 3, 4 ]} . 5-Aza-CdR可通过抑制基因启动区的高度甲基化 而恢复多种基因活性，逆转肿瘤的恶性表型^{[ 5, 6 ]}。 本研究通过5-Aza-CdR干预非小细胞肺癌细胞系 A549细胞后，检测TFPI-2 mRNA的表达，并观察 5-Aza-CdR处理后A549细胞的增殖、侵袭，以验 证5-Aza-CdR能通过去甲基化而恢复TFPI-2 mRNA 在非小细胞肺癌细胞株A549细胞中的表达，抑制 A549细胞的生长增殖和侵袭。 1 材料与方法 1.1 材料

A549细胞株购自武汉大学中国典型培养物保 藏中心；RPMI 1640培养液购自美国Hyclone 公 司；5-Aza-CdR、DMSO、MTT液及碘化丙啶均 购自美国Sigma公司；流式细胞仪购自美国BD公 司；Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；定 量PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司；荧光定量 PCR仪购自上海宏石医疗科技有限公司；Transwell 小室购自美国Corning公司。 1.2 细胞培养及实验分组

非小细胞肺癌细胞株A549细胞贴壁培养生长 于RPMI 1640培养液，内含10%的胎牛血清、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素，置于37℃、5%CO2的 恒温闭式培养箱内培养，细胞呈贴壁生长，将对 数期细胞以0.1%胰蛋白酶消化，传代。按不同浓 度的5-Aza-CdR分组：对照组：未加5-Aza-CdR干 预，加入等量普通培养液组。实验组：（1）加入 1 μM的5-Aza-CdR干预组。（2）加入5 μM的5-AzaCdR干预组。（3）加入10 μM的5-Aza-CdR干预组。 1.3 MTT法检测5-Aza-CdR处理后24、48、72 h的 细胞增殖活性

取处理前的对数生长期的细胞，按每孔接种 1×10⁴个细胞接种于96孔细胞培养板，每块培养 板共接种4组，每组3孔，接种后等细胞贴壁（24 h）后去上清液，实验组加入含不同浓度（1、5、 10 μM）的5-Aza-CdR培养液，对照组加入等量培 养液，继续置于37℃、5%CO2的恒温闭式培养箱 内培养，处理24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液 （10 mg/L）20 μl，孵育4 h，去除孔内上清液，每孔 加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），置振荡器振荡 10 min，使结晶物充分溶解。采用酶标仪于490 nm 波长处检测吸光度值（OD值），5-Aza-CdR对细 胞增殖活性的影响用细胞抑制率来表示，细胞增 殖抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组 OD值×100%，绘制细胞增殖曲线。实验重复3次。 1.4 FCM法检测药物处理72 h后的细胞周期分布

已传代的非小细胞肺癌A549细胞株在6孔培养 板培养24 h后，去除培养液，实验组加入含不同浓 度（1、5、10 μM）的5-Aza-CdR培养液，对照组 加入等量普通培养液，将培养板继续置于37℃、 5%CO2的恒温闭式培养箱内培养，72 h后回收细 胞，以0.1%胰蛋白酶消化并收集于4℃离心机离心 （1500 r/min，5 min），磷酸盐缓冲液（PBS）清 洗3次，70%冰乙醇固定，用RNaseA（终浓度为 0.1 g/L）消化30 min，加入0.05 g/L碘化丙啶（PI） 250 μl，室温避光染色30 min后上机检测。以增殖 指数（proliferation index,PI）衡量细胞分裂活动， PI=(S+G2/M)/(G₀/G₁+S+G2/M)。 1.5 Real-time PCR检测用药后细胞的TFPI-2 mRNA表达变化

收集5-Aza-CdR作用72 h后各组A549细胞， 用Trizol试剂提取各组细胞总RNA。用反转录酶和 Oliga(dT)20引物合成cDNA。TFPI-2 mRNA及内标 基因mRNA的引物序列，见表1。反应体系均为25 μl，PCR反应条件为：95℃预变性1 min，94℃变性 15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共进行40个循 环，72℃延伸5 min。溶解曲线：72℃→95℃，每20 s升温1℃。结果处理：ΔCt=Ct_TFPI-2−Ct_β-actin,ΔΔCt= ΔCt_实验组−ΔCt_对照组,相对mRNA表达倍数=2 ^－ΔΔCt。实验重复三次。

表1(Table 1)

表1 TFPI-2 mRNA及内标基因mRNA的real-time PCR引 物序列 Table 1 Real-time PCR primer of TFPI-2 mRNA and internal standard gene mRNA Notes:F:forward primer;R:reverse primer

表1 TFPI-2 mRNA及内标基因mRNA的real-time PCR引 物序列 Table 1 Real-time PCR primer of TFPI-2 mRNA and internal standard gene mRNA

于穿膜小室的下室内加入含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液，上室加入经不同浓度5-AzaCdR处理后的细胞悬液，每组设3个滤膜，置于培 养箱中作用24 h，将小室取出，用PBS洗去培养 液，结晶紫染色10 min；自来水将表面的结晶紫洗 除干净，用棉签将上室中的细胞擦除干净，于倒 置显微镜下(×200)对非细胞接种侧拍照,以穿膜细 胞数的多少表示细胞侵袭能力的大小。 1.7 统计学方法

计量数据均以均数±标准差(x±s) 表示。应 用SPSS 13.0统计软件分析，采用Levene法进行 方差齐性检验，若方差齐，数据采用方差分析 (ANOVA)检验，组间比较用LSD检验；若方差不 齐，用Games-Howell法进行分析。 2 结果 2.1 5-Aza-CdR处理24、48、72 h后的A549细胞生 长抑制率

5-Aza-CdR对A549细胞生长的抑制作用呈明显 的剂量和时间依赖性。当作用时间相同时，A549 细胞的生长抑制率随着5-Aza-CdR浓度的增加而 逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)；当5-AzaCdR浓度相同时，A549细胞的生长抑制率随着作 用时间的延长也逐渐增高，差异也有统计学意义 （P<0.05），见图1。

图1 不同浓度5-Aza-CdR作用不同时间后A549细胞的生 长抑制率曲线 Figure 1 Growth curve of A549 cells treated with different concentration of 5-Aza-CdR for different time

流式细胞仪检测显示，0、1、5、10 μM 5-Aza-CdR作用72 h后，随着其浓度的增加，G₀/G₁ 期的细胞数量逐渐增加，S期细胞数逐渐下降，细 胞增殖指数减低，与对照组相比，P<0.05，差异 有统计学意义，见表2。

表2(Table 2)

表2 不同浓度5-Aza-CdR处理A549细胞72 h后细胞周期的 变化(x±s,%) Table 2 Cell cycle change of A549 cells treated with different concentrations of 5-Aza-CdR for 72 h(x±s,%) Notes: *:P<0.05 vs. control group(0 μM)

表2 不同浓度5-Aza-CdR处理A549细胞72 h后细胞周期的 变化(x±s,%) Table 2 Cell cycle change of A549 cells treated with different concentrations of 5-Aza-CdR for 72 h(x±s,%)

经5-Aza-CdR处理72 h后，TFPI-2 mRNA重 新表达，与对照组相比，各实验组TFPI-2 mRNA 表达呈明显的上升趋势，5-Aza-CdR浓度为0、 1、5、10 μM时，相对mRNA水平分别为（1± 0）、（1.49±0.14）、（1.86±0.09）、（5.80± 0.15）（P<0.05），见图2。

*:P＜0.05 vs. control group(0 μM) 图2 不同浓度5-Aza-CdR处理A549细胞72 h后TFPI-2 mRNA的表达情况 Figure 2 Relative TFPI-2 mRNA expression after A549 cells treated with different concentration of 5-Aza-CdR for 72 h

Transwell小室上室细胞穿过matrigel到膜的 下室面，其细胞数量反映了细胞侵袭能力的大 小。收集5-Aza-CdR处理24 h后的A549细胞，采 用Transwell小室模型检测A549细胞侵袭情况。 5-Aza-CdR浓度为0、1、5、10 μM时，每一高倍 镜下平均穿膜细胞数（316.15±18.7）、（84.15± 12.14）、（28.85±7.13）、（14.35±3.33），与 对照组比较，实验组穿过滤膜的癌细胞数明显下 降，且与浓度相关(P<0.05)，见图3、4。

A:control group(0 μM);B:1 μM group;C:5 μM group;D:10 μM group 图3 不同浓度的5-Aza-CdR处理A549细胞24 h后高倍显微 镜下细胞穿膜结果(结晶紫染色 ×200) Figure 3 Cells transmembrane results of A549 cells treated with different concentration of 5-Aza-CdR for 24 h under high-power microscope(crystal violet staining ×200)

*:P＜0.05 vs. control group(0 μM) 图4 Transwell小室模型检测不同浓度5-Aza-CdR处理24 h 后A549细胞平均穿膜细胞数 Figure 4 Average cells transmembrane number of A549 cells treated with different concentration of 5-Aza-CdR for 24 h detected by Transwell assay

随着后基因组时代的到来，表观遗传学 (epigenetics)研究越来越受到重视，DNA甲基化为 表观遗传学的研究肿瘤开辟了一个新的领域^{[ 7, 8 ]}。研究表明，DNA甲基化与肿瘤的发生和演进密切 相关，它可通过基因组总体水平甲基化程度的降 低和某些启动子区域甲基化程度的增高造成基因 功能的失活，从而导致肿瘤的形成，这就是我们 常说的甲基化理论。启动子甲基化异常不是随机 事件，而是具有基因特异性和肿瘤特异性，启动 子甲基化在肿瘤的早期阶段、癌前阶段已存在， 可能是肿瘤发生的主要因素。迄今已发现许多恶 性肿瘤存在一个或多个肿瘤抑制基因启动子甲基化，这些相关的肿瘤抑制基因失活涉及多个环 节，如细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡、肿瘤 浸润等，从而导致恶性肿瘤的发生和进展^{[ 9, 10 ]}。近 年来研究发现在常见的恶性肿瘤（包括肺癌）， TFPI-2基因启动子区甲基化使TFPI-2表达下降或 者缺失，这与肿瘤的生长、浸润及转移有关^{[ 1, 2, 3, 4 ]}。 Rollin等^{[ 4 ]}研究发现TFPI-2基因甲基化失活能明 显增加非小细胞肺癌的侵袭作用。进一步研究发 现，TFPI-2基因启动子甲基化状态对于研究肿瘤 的发生、发展、预后具有重要意义。研究发现， 5-氮杂-2'-脱氧胞苷嘧啶能与DNA 甲基化酶共价结 合，抑制该酶的甲基转移活性，逆转肿瘤细胞的 基因甲基化，恢复mRNA转录活性和蛋白表达， 目前主要用于白血病等恶性白血液病治疗,并取得 了一定的疗效^{[ 11 ]}。

本研究将不同浓度的5-Aza-CdR作用于A549 细胞，MTT检测显示不同浓度的5-Aza-CdR处理 的A549细胞24、48、72 h后，细胞的生长受到抑 制，且抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性。 FCM检测分析显示G₀/G₁期细胞逐渐增加，出现 G₀/G₁阻滞，细胞增殖指数逐渐降低，随着5-AzaCdR浓度增加，细胞增殖指数逐渐降低。Real-time PCR检测显示TFPI-2 基因mRNA表达呈明显的上 升趋势，且随着药物浓度增加而增加。本研究结 果表明，5-Aza-CdR可通过抑制TFPI-2基因启动 子区的高度甲基化而恢复其转录活性，从而发挥 TFPI-2的抑制肿瘤生长及转移等作用。

侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是肿瘤治疗失败的主要原因。本研究结果显示 用不同浓度的5-Aza-CdR处理A549细胞后，其侵 袭能力逐渐降低，且随着5-Aza-CdR浓度的升高和 TFPI-2 mRNA表达水平的增高而下降，表明5-AzaCdR可能通过TFPI-2基因表达的恢复而抑制非小细 胞肺癌细胞的侵袭能力。

综上所述，5-Aza-CdR可抑制非小细胞肺癌 细胞的生长增殖并降低癌细胞的侵袭能力，其机 制可能与其干扰细胞周期并通过去甲基化作用提 高其TFPI-2基因的表达有关。因此，5-Aza-CdR有 可能成为非小细胞肺癌去甲基化治疗的新药物， TFPI-2可能是5-Aza-CdR治疗非小细胞肺癌有效的 分子标志物之一。