整合素是一类重要的细胞表面黏附分子，由 α（ITGA）亚基和β(ITGB)亚基所组成的异二聚体 跨膜糖蛋白。目前发现哺乳动物中有18种ITGA亚 基和8种ITGB亚基，组成24种整合素异二聚体。 整合素在多种细胞表面表达，通过与配体的结合 介导细胞之间的以及细胞、胞外基质之间的信号 转导，在细胞分化、胚胎发育及细胞黏附等方面 发挥非常重要的作用^{[ 1 ]}。在恶性肿瘤中，整合素 通过介导肿瘤细胞与基底膜、肿瘤细胞与宿主细 胞间的黏附及肿瘤发生发展过程中的多种信号传 递，直接或间接的影响肿瘤的生长、黏附、浸润 和迁移等多个环节^{[ 2 ]}。1993年发现的ITGA9亚基可 以与ITGB1亚基形成异二聚体，与IGTA4亚基组成 整合素的一个亚家族^{[ 3 ]}。作为最新的整合素亚家族 的一员，有关ITGA9的研究相对较少。本研究采 用RNA干扰技术抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F1中 ITGA9的表达，观察肿瘤细胞在小鼠体内的生长 及肺转移情况，为肿瘤靶向治疗新途径提供实验 依据。 1 材料与方法 1.1 材料

小鼠黑色素瘤细胞系B16F1，由芝加哥大学孟 玉茹教授提供。用含10%胎牛血清的RPMI1640培 养液，置37℃、5%CO2培养箱中培养。ITGA9靶 向shRNA质粒（ITGA9-shRNA）、阴性对照质粒 （scramble-shRNA）、转染试剂和转染培养液购 自Santa Cruz公司 。RNA提取试剂盒、反转录试剂 盒和PCR试剂盒为大连宝生物公司产品。兔抗小鼠ITGA9单克隆抗体购自Abcam公司。 1.2 方法 1.2.1 shRNA质粒转染B16F1细胞与稳定筛选

将 对数生长期的细胞接种到6孔板，用含10%胎牛 血清的RPMI 1640培养液置37℃，5%CO2培养箱 中培养。等到细胞长至60%~70%融合，按说明书 用转染培养液和转染试剂将ITGA9-shRNA转染细 胞，置37℃，5%CO2培养箱中培养。6 h后更换新 鲜10%胎牛血清RPMI1640培养液。转染24 h后， 将6孔板中的细胞消化，转至培养瓶中培养。待细 胞长至80%融合，用含1 μg/ml嘌呤霉素（Merck公 司）的10%胎牛血清RPMI 1640培养液培养3d，收 集细胞进行Western blot和RT-PCR检测，并冻存。 1.2.2 荧光定量RT-PCR检测ITGA9 mRNA表 达

首先提取细胞总RNA，用1μgRNA反 转录成cDNA。特异性扩增引物由英潍捷基 （上海）合成，ITGA9的上游引物序列为5’- AAGTGTCGTGTCCATACCAAC-3’,下游引物序 列为5’-GGTCTGCTTCGTAGTAGATGTTC-3’； 内参β-actin的上游引物序列为5’-GACCCAGA TCATGTTTGAGACC-3’,下游引物序列为5’- ACGACCAGAGGCATACAGG-3’。PCR循环： 95℃30 s预变性，95℃5 s，60℃30 s共40个循环。 1.2.3 Western blot检测ITGA9蛋白表达

用RIPA （含1%PMSF蛋白酶抑制剂）裂解细胞提取总蛋 白，测蛋白浓度。配置10%的分离胶和5%的浓缩 胶，每孔上40 μg蛋白进行SDS-PAGE，转至PVDF 膜。膜经封闭后，加ITGA9一抗，4℃过夜。经洗 涤，加二抗（凯基生物公司）室温孵育2 h。洗涤 后，DBA显色，数码照相。 1.2.4 动物实验分组

SPF级雌性、6~8周龄 C57BL/6小鼠24只，购自南方医科大学实验动物 中心。随机分为A、B、C3组，每组8只。A组为 ITGA9-shRNA转染组，B组为阴性对照scrambleshRNA转染组，C组为空白对照组。 1.2.5 皮下成瘤及肺转移动物模型的建立

取对 数生长期的B16F1细胞，用胰酶消化后，离心收集细 胞，加PBS制成单细胞悬液，调整密度为1×10⁷/ml。 于小鼠后肢的外侧部位皮下注射100 μl单细胞悬液 （1×10⁶个细胞），建立皮下成瘤模型。同时，经 小鼠尾静脉注射1×10⁶个细胞，建立肺转移模型。 1.2.6 观察指标

观察注射后小鼠皮下成瘤情 况，每3天用游标卡尺测肿瘤长径(a)、短径(b)，利 用公式计算肿瘤体积(V=ab²/2)，绘制肿瘤生长曲 线。3周后，处死小鼠并解剖取双肺，计数肺部转 移灶的数目。 1.3 统计学方法 实验数据以x±s表示，用SPSS 10.0软件进行单 因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 ITGA9-shRNA质粒转染B16F1细胞对ITGA9 表达的影响

RT-PCR和Western blot结果显示，与scrambleshRNA和空白对照相比，在mRNA水平和蛋白水 平，ITGA9-shRNA转染B16F1成功抑制了ITGA9 的表达，抑制率分别为67%（P＜0.05）和50%（P ＜0.05），见图1、2。

1:B16F1 cells;2:scramble-shRNA transfected B16F1 cells;3:ITGA9-shRNA transfected B16F1 cells 图1 荧光定量RT-PCR检测细胞ITGA9 mRNA的表达 Figure 1 Expression of ITGA9 mRNA detected by qRTPCR

1:B16F1 cells;2: scramble-shRNA transfected B16F1 cells;3:ITGA9-shRNA transfected B16F1 cells 图2 Western blot检测细胞IGTA9蛋白水平的表达 Figure 2 Expression of ITGA9 protein detected by Western blot

小鼠肿瘤体积生长曲线见图3。ITGA9-shRNA 组的肿瘤生长与scramble-shRNA组和空白对照组 相比显著减慢（P＜0.05）。在实验终点，ITGA9-shRNA组的肿瘤平均体积与阴性对照组相比下降 36%。3周后处死小鼠，取双肺，计数肺表面转移 灶的数目。scramble-shRNA组和空白对照组中肺部 转移灶平均值分别为（43.13±6.79）个和（43.38± 6.323）个，而ITGA9-shRNA组的肺部转移灶明显减少（P＜0.05），仅为 （18.13±4.74）个，见图4。

图3 各组小鼠肿瘤生长曲线 Figure 3 Growth curves of subcutaneous tumor volume

图4 各组小鼠肺转移灶数目 Figure 4 Number of lung metastatic lesions

恶性肿瘤表达的黏附分子与肿瘤的生长、侵袭 和转移密切相关。黏附分子通过与配体结合启动 细胞的多条信号通路，影响细胞的生物学行为，同 时也改变细胞本身的特性^{[ 4 ]}。多项研究表明，整合 素在恶性肿瘤中的表达发生改变。改变表达的整 合素影响肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用，促 进肿瘤细胞迁移，并有助于其存活^{[ 5 ]}。整合素有望 成为应用于临床抗肿瘤新药研发的靶点^{[ 6 ]}。 ITGA9在多种肿瘤中表达发生改变。它高表达 于肺癌，特别是小细胞肺癌，可能是预后不良的指 标^{[ 7 ]}。还有研究表明整合素α9β1是basal-like型乳腺 癌的分子标志并提示患者的无转移生存期和总生存 期短^{[ 8 ]}。多项实验研究表明ITGA9与肿瘤的侵袭、 迁移有关^{[ 9, 10 ]}。黑色素瘤恶性程度高，晚期转移患 者的治疗效果并不理想，新的治疗方法和治疗靶点 亟需进一步研究。ITGA9是否在黑色素瘤的侵袭、 迁移中发挥重要作用，需要进一步验证。

本实验用RNA干扰技术，下调B16F1细胞的 ITGA9的表达，在小鼠体内观察到肿瘤生长减 慢，提示ITGA9可抑制B16F1的局部生长。其机制 可能为下调ITGA9影响了B16F1的增殖、分化以及 肿瘤血管生成等环节，需进一步探讨。此结果提 示ITGA9可能是黑色素瘤治疗的潜在靶点。

本实验使用高转移性的黑色素瘤细胞株 B16F1，静脉注射建立肺转移模型，该模型可以很 好的评价处理因素对肺转移的影响。一般认为，进 入小鼠血液循环的恶性肿瘤细胞是通过黏附毛细 血管内皮细胞，穿过基底膜，迁移至组织内增殖， 最终形成转移灶。ITGA9-shRNA转染的B16F1细胞 在小鼠体内形成的肺转移灶减少，提示ITGA9影响 B16F1细胞从黏附、穿过血管内皮到进入组织形成 转移灶这一系列环节中的一个或多个环节。这种肺 转移抑制作用也可能与肿瘤细胞在血液循环中的存 活率降低有关。以上结果表明ITGA9有希望成为抑 制黑色素瘤转移的治疗靶点。