骨肉瘤（osteosarcoma,OS）来源于初始的间 质细胞，原发于骨组织，OS是骨组织最常见的原 发性恶性肿瘤，恶性度很高并且青少年多发^{[ 1 ]} 。

在15~19岁之间的青少年人中发生率最高，常伴有 病理性骨折、顽固性骨痛、脊髓及周围神经压迫 症状。目前OS的治疗主要是辅助化疗结合手术。 铂类药物在其化疗中有着非常重要的作用，第3代 铂类药物洛铂(Lobaplatin,LBP)的抗肿瘤效果与顺 铂（DDP）和卡铂（CAP）相当甚至更好，不良 反应更低，且与DDP无交叉耐药，已经用于多种 恶性肿瘤的治疗。本研究选取LBP作用于MG-63 细胞，采用MTT比色法、流式细胞技术检测、 Western blot等方法分析LBP对MG-63细胞的增殖抑制、细胞周期阻滞、细胞凋亡诱导等作用，在分 子和细胞水平初步探讨其可能的作用机制，从而 为LBP在OS化疗中的应用提供相应的理论基础和 实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料

MG-63细胞株购自中科院上海细胞库，CO²培 养箱（EL312e）购自美国，96孔细胞培养板购自 上海研拓生物科技有限公司，酶联免疫检测仪购 自上海京工实业有限公司，FACS-420型流式细胞 仪购自美国Becton Dickinson公司，兔抗人Bcl-2一 抗购自上海亿欣生物试剂公司，羊抗兔二抗购自 南京生兴生物技术有限公司，倒置相差显微镜购 自日本尼康公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

MG-63细胞株在37℃、5%CO²、饱和湿度条 件下，用含10%灭活小牛血清的RPMI 1640全培养 液培养，每2~3天传代1次。实验均取对数生长期 细胞，调整细胞浓度为(0.5~1)×10⁴/ml。接种细胞 24 h进入对数生长期后开始加药。 1.2.2 实验分组及用药情况

将MG-63细胞接种于25 ml细胞培养瓶中，加 入RPMI 1640细胞培养液4 ml，于37℃、5%CO²、 饱和湿度的恒温培养箱中培养24~48 h后倒掉培养 液，加入0.25%胰蛋白酶消化液1~2 ml，消化约 5~7 min，弃去消化液，并制成单细胞悬液，调整 细胞密度为1×10⁴/ml，接种于96孔细胞培养板中。 然后随机分为A、B两组，A组：为对照组（单细 胞悬液+同等体积的0.9% NaCl）；B组：洛铂处理 组，设3个浓度梯度，加入药物浓度分别为2、4、 8 μg/ml。以上各组分别设3个复孔。置于37℃、 5%CO²、饱和湿度的恒温培养箱中培养48 h。培养 期间注意观察培养液性状，如有必要则换液一次 并分别加入浓度为2、4、8 μg/ml的药物，同时对 照组也换液一次并加入等体积0.9% NaCl。 1.2.3 观察细胞形态学变化

将密度为1×10⁴/ml的细胞悬液接种到无菌96孔 细胞培养板上，设不同浓度的实验组和对照组， 每组3个复孔，共计12孔，每孔加入100 μl细胞悬 液置培养箱内培养24 h。待细胞贴壁生长后再更换 培养液，并加入不同浓度的洛铂，对照组加入同 等体积的0.9% NaCl，继续培养48 h后，光学显微 镜下观察细胞形态学改变。 1.2.4 测定并绘制细胞生长曲线

按1×10⁴/孔的密度将MG-63细胞悬液接种到无 菌96孔细胞培养板上，培养箱内培养24 h，更换培 养液。按实验分组加入不同浓度的洛铂，每24 h取 3孔进行细胞计数，连取7天，取其平均值绘制细 胞生长曲线。 1.2.5 细胞增殖抑制实验

采用MTT比色法检测细胞增殖抑制情况。取 对数生长期细胞，经消化后制备成浓度为1×10⁴/ml 的细胞悬液，按实验分组情况接种到无菌96孔细 胞培养板上，每孔加入细胞悬液100 μl，每组设3 个复孔。于细胞培养箱内培养24 h，待细胞贴壁 后更换培养液，并按照实验设计，实验组加入不 同浓度的洛铂溶液，对照组加入同等体积的0.9% NaCl。继续放入培养箱内培养，并按时间梯度 （24、48、72 h）依次采集细胞，每孔加入MTT溶 液20 μl（5 mg/ml），继续培养4 h后吸弃培养孔内 的上清液，然后每孔加入二甲基亚砜（DMSO） 150 μl，振荡10 min，使蓝紫色结晶物充分溶解。 于酶联免疫检测仪上，选择490 nm波长，测定各 孔光吸收值（A值），计算细胞生长率=（A实验组- A对照组）/A对照组×100%，对比各组的细胞生长率差 异。 1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期

采用碘化丙啶（propidium Iodide,PI）一步插 入法DNA定量荧光染色法。将实验组不同药物浓 度干预下的细胞制备成单细胞悬液并用70%的乙醇 固定，冰浴30 min。每份待测样本中加入预先配置 的DNA荧光染液1 ml，置4℃冰箱内染色30 min， 调整每份样本的细胞数为1×10⁶/ml，上机检测前 去除样本中70%的乙醇。应用FACS-420型流式细 胞仪检测、分析样本的细胞凋亡率和细胞周期， 每份样本检测1×10⁵个细胞，每组检测3个样本并 重复3遍。细胞DNA周期则通过B.D公司提供的流 式细胞分析软件，计算出细胞周期各时相分布的 百分比，依据细胞时相分布计算出细胞增殖指数 （PI），公式为：PI=[ (S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M) ]×100%。 1.2.7 Western blot检测Bcl-2蛋白表达

取处于对数生长期的MG-63细胞，0.25%胰酶 消化后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整 细胞浓度为1×10⁴/ml，将细胞悬液加入100 ml培养 瓶中培养。实验分给药组、空白对照组。培养24 h后， 给药组加入浓度分别为2、4和8 μg/ml的洛铂，空 白对照组加入等体积0.9% NaCl,继续培养48 h。用Bradford法测定蛋白含量,取50 μg蛋白用12%的 分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺 凝胶电泳，电泳完毕后，用半湿转膜50 mA电转 2 h将蛋白转移到NC膜上。取出膜用含3% BSA的 TTBS 4℃封闭过夜。TTBS洗膜3次，每次5 min， 加1:250稀释的兔抗人Bcl-2一抗，杂交3 h后TTBS 洗膜3次，每次5 min,然后加碱性磷酸酶标记的 1:7 500稀释的羊抗兔二抗，2 h后取出膜，TTBS洗 3次，每次5 min。加入显色剂闭光显色，显色后凝 胶成像系统照相并用分析软件对蛋白含量进行定 量。提取6次不同的样本，重复实验6次。数据以 空白对照组为100%，计算各个样品相对于空白对 照组蛋白含量的百分率，进行统计和方差分析。 1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件t检验、单因素多样 本比较的方差分析进行统计学处理。Levene方差 齐性检验结果P＞0.05可认为样本方差齐，检验水 准α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 洛铂对MG-63细胞形态学的影响

经不同药物浓度的洛铂溶液作用细胞48 h后， 于倒置相差显微镜下进行观察可见：对照组细胞 生长状态良好，密度较大，细胞长势旺盛，贴壁 性好。细胞透明，呈梭形或多边形，细胞内颗粒 较少，细胞核可见，见图1A；实验组细胞生长状 态较差，密度显著减小，贴壁性不佳，对数期细 胞含量少，漂浮细胞含量明显增多。肿瘤细胞回 缩呈圆形或类圆形，细胞间隙增大，细胞膜折光 性增强，胞质浑浊，颗粒感增强，细胞核固缩， 甚至可见部分细胞裂解，见图1B~1D。上述现象 随洛铂浓度的增加更见明显。

A:control group; B,C and D:treated with lobaplatin at 2,4 and 8 μg/ml,respectively 图1 洛铂作用MG-63细胞48 h后的细胞学形态改变 (10×10) Figure 1 Morphological changes of MG-63 cells treated by Lobaplatin for 48h(10×10)

不同剂量的洛铂作用于MG-63细胞后，每天 取一组细胞，经倒置相差显微镜计数，连续观察7 天，并绘制细胞生长曲线。结果显示，与对照组 相比较实验组细胞的增殖受到明显的抑制，并且 这种抑制现象随着洛铂药物剂量的增加与作用时 间的延长而显著增强，见图2。

图2 不同剂量的洛铂作用MG-63细胞7天后的生长曲线 （n=84,s=0.076） Figure 2 Growth curves of MG-63 cells treated by different doses of Lobaplatin for 7 days (n=84,s=0.076)

采用MTT法测定细胞增殖抑制率。对照组细 胞正常生长，不同药物剂量洛铂作用相同时间以 及相同药物剂量作用不同时间的实验组细胞生长 均受到不同程度的抑制。不同药物剂量洛铂（2、 4、8 μg/ml）作用相同时间，MG-63细胞增殖抑制 率存在差异，且各组之间差异均有统计学意义（P ＜0.05），随药物浓度的增加细胞增殖抑制率逐渐 增大，与对照组相比较差异均有统计学意义，且 实验组之间差异也有统计学意义（P＜0.05），见表 1。体现了洛铂能够抑制MG-63细胞增殖，且呈浓 度和时间依赖效应。

表 1(Table 1)

表 1 MTT比色法分析洛铂在MG-63细胞增殖中的作用（x±s） Table 1 Effects of Lobaplatin on the proliferation of MG-63 by MTT colorimetric method (OD) (x±s) Notes:*:P<0.05; △:P<0.05

表 1 MTT比色法分析洛铂在MG-63细胞增殖中的作用（x±s） Table 1 Effects of Lobaplatin on the proliferation of MG-63 by MTT colorimetric method (OD) (x±s)

因表达的影响 经不同药物浓度的洛铂作用的各组细胞上 机后均可检测到亚G1期细胞（凋亡细胞），见 图3B~3D，而对照组细胞则未见细胞凋亡峰， 见图3A。2、4、8 μg/ml洛铂均可诱导MG-63细 胞凋亡，与对照组比较差异均有统计学意义（P ＜0.05），不同剂量的洛铂组间进行比较，差异有 统计学意义（P＜0.05），见表 2。

A:control group; B,C and D:treated with lobaplatin at 2,4 and 8μg/ml respectively 图3 流式细胞术检测MG-63细胞应用洛铂处理48 h后的细 胞凋亡情况 Figure 3 Effects of Lobaplatin on the apoptosis of MG-63 cells detected by FCM for 48 h

表 2(Table 2)

表 2 流式细胞术检测洛铂处理48 h后对MG-63细胞周期的 影响（x±s） Table 2 Effects of Lobaplatin on cell cycle in MG-63 by FCM for 48 h（x±s） Notes:*:P<0.05; △:P<0.01

表 2 流式细胞术检测洛铂处理48 h后对MG-63细胞周期的 影响（x±s） Table 2 Effects of Lobaplatin on cell cycle in MG-63 by FCM for 48 h（x±s）

检测凋亡相关基因Bcl-2的表达。经不同药物 浓度的洛铂作用各组细胞48 h后，用Western blot检 测结果显示：随洛铂剂量不断增加，Bcl-2蛋白表 达量逐渐降低，见图4。

图4 蛋白印迹技术分析洛铂处理48 h后Bcl-2的表达水平(x±s) Figure 4 Effects of Lobaplatin on the expression of Bcl-2 in MG-63 detected by Western blot for 48h ( x±s)

OS的发病率逐渐上升，其治疗效果欠佳。而 且OS有较高的转移率，大约20%的患者在初次诊 断OS时已发生了肺转移，另外40%的患者稍晚发 生转移。其中80%的患者发生肺转移，另外转移瘤 容易对常规的化疗产生耐药性^{[ 2 ]}。LBP是第三代铂 类抗癌新药，其抗肿瘤作用机制是通过形成Pt-GG 和Pt-AG链内交叉连接，阻碍DNA的复制和转录 过程,从而干扰肿瘤细胞周期的运行，还能使DNA 模板失活，从而使DNA聚合酶不能发挥其催化作 用，对细胞周期中各期均有不同程度的影响。

LBP是德国ASTA公司研发的第三代铂类药 物，化学名为1，2-二氨甲基-环丁-乳酸合铂，其 对多种动物和人的肿瘤细胞株有明确的细胞毒 作用。第3代铂类药物LBP的抗肿瘤效果与顺铂 （DDP）和卡铂（CAP）的作用更好，临床前研 究显示，LBP的抗癌指数等于或高于顺铂或卡铂， 不良反应较DDP、CAP低。LBP具有水溶性高、细 胞毒性强、肾毒性低、胃肠道反应及骨髓抑制轻 的特点，与DDP无交叉耐药^{[ 3 ]}。其在非小细胞肺癌 及乳腺癌中有较高的疗效，研究证实LBP可以克 服肿瘤对DDP 、CAP的耐药性^{[ 4 ]}，因此对于耐DDP 的OS可以应用LBP进行进一步治疗，而且与其他 抗肿瘤药物联合应用时其不良反应可以耐受^{[ 5 ]}。 凋亡异常与恶性肿瘤的发生、发展和预后密 切相关，通过形态学观察、流式细胞术和Western blot等检测来分析不同LBP浓度干预下MG-63细胞 的凋亡、相关蛋白表达以及细胞周期的变化。本 实验形态学观察显示，LBP促进MG-63细胞裂解凋 亡。流式细胞仪检测显示MG-63细胞凋亡率随LBP 浓度的增加而增大，MG-63细胞存活细胞数量与LBP剂量具有明显浓度梯度依赖关系。Western blot 显示：Bcl-2蛋白表达量随洛铂剂量不断增加而逐 渐降低，从而促进MG-63细胞凋亡。细胞周期分 析显示，不同药物浓度的LBP作用细胞48 h后，细 胞G0~G1期与S期细胞数量明显增加，G2~M期细胞 分布百分率则表现为下降趋势。这一现象说明， LBP能够直接诱导体外培养的MG-63细胞系凋亡， 而且呈现浓度依赖性。LBP作用于细胞后可以使 细胞停滞在DNA合成前期，并在此期抑制细胞增 殖、诱导细胞凋亡。

细胞凋亡是受多种因素影响的，其中主要包 括促凋亡因子（Pro-Apoptopic）和抗凋亡因子 （Anti-Apoptotic）^{[ 6 ]}。目前已经证实的促凋亡基因 有c-myc、c-myb、P53、Fas等；抗凋亡基因主要 有Bcl-2、Bcl-xL等；Takayama等^{[ 7 ]}报道Bcl-2是许多 生理性细胞凋亡的关键性调节因子，在细胞凋亡 的内源性共用通道调节上起到至关重要的作用。其过度表达可以减少细胞凋亡，使机体引发增殖 性疾病或恶性肿瘤。多项研究表明，在恶性肿瘤中 高表达Bcl-2与其不良预后有关，体外实验证明， 肿瘤细胞高表达Bcl-2导致化疗及放疗抵抗^{[ 8 ]}。当进 行化疗或放疗时，肿瘤细胞不是因此凋亡而是基因 变得不稳定，肿瘤细胞凋亡失控缘于Bcl-2家族蛋 白高表达，因此用药物干预Bcl-2途径能够获得满 意临床效果^{[ 8 ]}。目前临床常用的化疗药物许多都是 通过降低Bcl-2蛋白的表达来诱导细胞凋亡。大量 研究表明化疗能通过线粒体途径对体外培养的肿 瘤细胞下调Bcl-2蛋白促进肿瘤细胞凋亡^{[ 9, 10, 11 ]}。实验 通过Western blot检测显示LBP在体外可使MG-63细 胞凋亡抑制基因Bcl-2表达减弱。这一现象表明， LBP在体外促进MG-63细胞凋亡的机制之一可能是 通过抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达来实现的。

在本实验研究中，无论是形态学观察还是流 式细胞术检测，结果均显示在体外LBP能够明显促 进MG-63细胞凋亡、抑制MG-63细胞增殖以及改 变MG-63细胞周期，且呈浓度和时间依赖性，这 表明LBP可能在OS治疗方面具有一定作用。缘于 实验时间及实验条件的限制，本研究未能进行动 物模型实验和人体临床试验，但在MG-63细胞系 中LBP已显示出了抗OS细胞增殖、促OS细胞凋亡的独特优势，因此LBP在OS中的作用需要进一步 研究。