目前多发性骨髓瘤仍然难以治愈。在硼替佐 米(bortezomid,BZM)等新药出现之前，中位生存 期仅3年。但BZM不能根治多发性骨髓瘤，且随 着其临床应用范围的扩大和时间的推移，部分患 者对BZM产生了耐药反应，因此人们寻找新的抗 多发性骨髓瘤药物，或者以BZM为基础的联合治疗方案等，以进一步提高多发性骨髓瘤患者的生 存率和治愈率^{[ 1, 2 ]}。力达霉素(lidamycin,LDM)是 大分子肽类抗肿瘤抗生素，LDM具有较强的抗肿 瘤活性^{[ 3, 4, 5, 6, 7 ]}，前期结果证实其具有抗多发性骨髓瘤 作用。我们经过前期实验^{[ 7 ]}的摸索，选取了适当 的LDM、BZM和通路抑制剂浓度，本实验拟研究 LDM联合BZM抗骨髓瘤作用，为今后两药联合在 多发性骨髓治疗中的应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料

鼠骨髓瘤细胞U266由本室传代保存。用 含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI 1640培养液 (Gibco)，于37℃、5% CO²、饱和湿度条件下培 养，2 d传代1次，实验用细胞为对数生长期细胞。 力达霉素由中国医学科学院医药生物技术研究所 甄永苏院士惠赠。主要实验材料还有：蛋白定量 试剂盒（BCATM protein assay kit）（皮尔斯，美 国伊利诺伊州）；宽范围蛋白预染Marker（新英 格兰生物公司，美国马萨诸塞州）；蛋白质印迹 发光液和PVDF膜（密理博公司，美国马萨诸塞 州）；Actin抗体(sc-1616) （圣克鲁斯公司，美国 马萨诸塞州）；HRP 标记的羊抗兔、兔抗羊、羊 抗小鼠IgG 抗体（北京中杉金桥有限责任公司， 中国北京）；MAPK家族成员抗体试剂盒、磷酸 化MAPK家族成员抗体试剂盒（细胞信号技术公 司，美国马萨诸塞州）；JNK抑制剂SP600125、 p38 MAPK抑制剂SB203580和MEK抑制剂U0126 （默克公司，中国北京）。 1.2 方法 1.2.1 细胞增殖活性检测MTS 法测定细

胞存活率，MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium,inner salt]是MTT的一种新型类似 物，化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2-磺)-5- (3-羧甲基 氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2氢四唑内盐，简称MTS。 原理是MTS在PMS (phenazine methosulfate) 存在 的情况下可被活细胞内的脱氢酶类还原，转化成 液态可溶的产物，而死细胞无此功能，该水溶物 可用酶标仪在波长490 nm 处检测，测定在490 nm 波长处的吸光度值，该值可间接反映活细胞的数 量和活性。取对数生长期的细胞，轻轻吹打分散 成细胞悬液，计数后以1×10⁴个/孔的密度接种细 胞于96孔细胞培养板中，2 h 后加入不同浓度的药 物处理48 h,每组至少3个平行孔。每孔加入20 μl MTS和PMS混合液（按说明书配制：每2 ml MTS 溶液中加入100 μl PMS，现用现配），37℃继续培 养1~4 h，用酶标仪(Thermo Labsystems,Multiskan MK3) 于490 nm处测定每个孔的吸收度(A490)值。 实验设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下 面公式计算细胞的存活率：细胞存活率＝（加药 组A490值－空白组A490值）／（对照组A490值－空白 组A490值）×100%。实验重复3次。为了研究JNK、 p38 MAPK和ERK的激活在LDM联合BZM抑制 U266细胞增殖中的作用，分别用相应的抑制剂 （SP600125、SB203580和U0126）预处理U266细 胞2 h，再加入LDM (0.5 nmol/L)和BZM(10 nmol/L) 继续作用48 h后，用MTS法检测细胞增殖抑制状 况。 1.2.2 Western blot分析

收集不同药物作用48 h及 未加药处理的U266细胞，用预冷的1×PBS洗3遍， 加入新鲜配制的细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5；1% NP-40; 150 mmol/L NaCl; 1 mmol/L Na3VO4; 1 mmol/L NaF，临用时加入3种蛋白酶抑 制剂：1% 抑蛋白酶肽、10 g/L 亮抑酶肽；1 mmol/ L 苯甲基磺酰氟) 100 μl，细胞与裂解液充分混合， 冰浴20 min。于4℃，13 000 mmol/L 离心15 min， 收集上清液于新的微量离心管中，按照BCA法测 定蛋白含量。取各样品等量总蛋白30 μg加入0.25 倍体积的5×上样缓冲液，煮沸变性5 min后，在 10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)胶上进行电泳。然后转移到硝酸纤维 素膜上，1% BSA封闭1 h，一抗4℃孵育过夜后， 加相应二抗孵育2 h，膜上滴加化学发光增强剂 (SC-2048，美国Santa Cruz 生物公司)，按照试剂说 明进行操作，通过凝胶成像系统拍照保存结果。 1. 3 统计学方法

计量资料以均值±标准差（x±s）表示，采用 SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析比较各组 间的差异，采用 t 检验进行两组之间比较，P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 MTS检测LDM联合BZM对U266细胞增殖的 影响

LDM联合BZM作用U266细胞48 h后，能显著 抑制细胞的增殖，与LDM和BZM单药比较差异有 统计学意义，见图1。

Each point represents x±s(n=3), *：P<0.05, the combination versus LDM or BZM;BZM:bortezomib;LDM:lidamycin 图1 LDM联合BZM对U266细胞增殖的影响 Figure 1 Proliferation inhibition of U266 cells by BZM (5 nmol/L), LDM (0.5 nmol/L) and the combination

0.5 nmol/L 的LDM作用U266细胞48 h后，可 激活磷酸化的JNK、p38 MAPK和ERK的表达， LDM与BZM（5 nmol/L）联合用药后，可使JNK 和p38 MAPK的激活显著增强，而ERK的激活显著 下降，见图2。

Each point represents x±s(n=3), *: P <0.05, LDM vs.control; #: P<0.05, the combination vs.LDM 图2 Western blot检测LDM联合BZM对U266细胞MAPKs表达的影响 Figure 2 The effects of LDM combined with BZM on MAPKs expression in U266 cells detected by Western blot

BZM (5 nmol/L)联合LDM (0.5 nmol/L)作用 U266细胞48 h后，能显著抑制细胞的增殖，与 LDM和BZM单药比较差异有统计学意义，但联合 用药合用JNK抑制剂SP600125后，降低了对细胞 的增殖抑制作用，与联合用药比较差异有统计学 意义，见图3。

SP:SP600125; each point represents x±s(n=3), *: the combination vs. LDM or BZM, P<0.05; #: the combination plus inhibitor SP600125 vs. the combination, P<0.05 图3 BZM、LDM联合用药及合用SP600125对U266细胞增殖的影响 Figure 3 Anti-proliferation of U266 cells by BZM, LDM, the combination, and the combination plus SP600125

BZM (5 nmol/L)联合LDM (0.5 nmol/L)作用 U266细胞48 h后，能显著抑制细胞的增殖，与 LDM和BZM单药比较有显著性差异，但联合用药 合用p38 MAPK抑制剂SB203580后，降低了对细胞 的增殖抑制作用，与联合用药比较差异有统计学意义，见图4。

SB:SB203580; each point represents x±s(n=3), *: the combination vs.LDM or BZM, P<0.05; #: the combination plus inhibitor vs.the combination, P<0.05 图4 BZM、LDM联合用药及合用SB203580对U266细胞 增殖的影响 Figure 4 Anti-proliferation of U266 cells by LDM, BZM, the combination, and the combination plus SB203580

BZM (5 nmol/L)联合LDM (0.5 nmol/L)作用 U266细胞48 h后，能显著抑制细胞的增殖，与 LDM和BZM单药比较差异有统计学意义，但合用 MEK抑制剂U0126后，增强了对细胞的增殖抑制作 用，与联合用药比较差异有统计学意义，见图5。

Each point represents x±s(n=3), *: the combination vs.LDM or BZM, P<0.05; #: the combination plus inhibitor vs.the combination, P<0.05 图5 BZM, LDM联合用药及合用U0126对U266细胞增殖 的影响 Figure 5 Anti-proliferation of U266 cells by LDM, BZM, the combination, and the combination plus U0126

力达霉素属于烯二炔类抗生素，它可诱导DNA 单、双链的断裂。大量研究表明，力达霉素具有 较强的抗肿瘤活性^{[ 3, 4, 5, 6, 7 ]}。前期结果显示，LDM通过 激活JNK和p38 MAPK抑制骨髓瘤细胞增殖，而 LDM作用后ERK的激活有利于细胞生存^{[ 7 ]}。硼替 佐米是首个用于临床的蛋白酶体抑制剂，2003年5 月，美国食品药物管理局（FDA）批准硼替佐米 用于多发性骨髓瘤患者。

本实验结果显示BZM能增强LDM的抗骨髓 瘤作用，LDM激活MAPK家族的三个主要成员： c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)、p38 MAPK的表达和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated rotein kinase,ERK)， 这一结果和我们前期研究结果吻合，两药联合后 可使JNK和p38 MAPK的激活显著增强，而ERK的 激活显著下降。分别应用JNK抑制剂(SP600125)、 p38抑制剂(SB203580)和MEK抑制剂(U0126)与 LDM联合BZM合用，观察对细胞增殖的影响。结 果显示单独的3种抑制剂对细胞的增殖抑制作用均 不明显，但SP600125或SB203580分别与LDM联合 BZM合用后均降低了两药联合对细胞的增殖抑制 作用，而U0126与LDM联合BZM合用后提高了两 药联合对细胞的增殖抑制作用。

MAPK属于丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于 哺乳动物细胞的胞质中，参与调节细胞生长、发 育、分裂、死亡以及细胞间的功能等一系列生命 活动^{[ 8, 9 ]}。研究表明MAPK家族中的这三个主要成 员：JNK、p38 MAPK和ERK均既有抗增殖、促凋 亡作用又有促增殖、抗凋亡作用^{[ 10, 11, 12, 13 ]}，这取决于细 胞的类型、死亡刺激的性质及活化的持续时间和 其他信号通路的活性。

MAPK信号转导通路是一个复杂的网络系统， 在哺乳类细胞中各个MAPK信号通路之间通过复 杂的机制既可相互区别，又可相互调节，既有自 身的独立性，相互间又有千丝万缕的联系。JNK、 p38 MAPK和ERK三条通路，或是在上游蛋白激 酶，或是在下游作用底物处，总是有其通路的交 汇。这种复杂的、多联系的网络系统是确保细胞 反应精确性和准确性的关键，细胞对外界刺激的 反应是综合了各个信号通路之间的激活和（或） 抑制效应而产生的。

综上所述，BZM能增强LDM的抗骨髓瘤作 用，这种增强作用是通过进一步激活JNK、p38 MAPK和降低ERK的激活来实现的。本实验为 LDM联合BZM抗多发性骨髓瘤的体内实验和临床 试验研究提供了理论依据。