特异性泛素蛋白酶22（USP22）是泛素水解酶 家族成员之一，具有去泛素的作用^[1]。USP22 的N 末端是锌指结构域，能和人类染色质重塑复合体 SAGA（hSAGA ）中的其他亚单位相互作用，C末端是泛素水解酶活性区，能够水解组蛋白H2A 和H2B上的泛素，从而使hSAGA 表现出转录辅助 激活因子的作用，激活靶基因转录^[2]。相关研究表 明：USP22在多种实体肿瘤细胞中呈现高表达,并 且其表达程度与肿瘤转移潜能、化疗耐药性及患 者预后密切相关^{[3, 4, 5, 6, 7]}。目前关于USP22在急性白血 病细胞中的表达情况报道较少，本研究意在探讨 USP22在急性白血病细胞中的表达及其临床意义。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选择2012年10月—2013年6月郑州大学第一 附属医院血液内科就诊的住院患者83例为研究对 象，其中男47例，女36例，年龄16~72岁，中位年 龄为34岁。急性白血病患者诊断及缓解标准参照 张之南第三版《血液病诊断及疗效标准》^[8]。另选 白血病细胞系Jurkat（急性T细胞白血病细胞）、 HL-60（人急性早幼粒白血病细胞）、K562（人 慢性髓系白血病细胞）、molt-4（人急性淋巴母细 胞性白血病细胞）和NB4(急性早幼粒细胞白血病 细胞)，均由郑州大学干细胞中心提供。 1.2 研究分组

初诊组包括49例初诊为急性白血病患者，其 中急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML） 31例，急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)18例，缓解组包括19例治疗后达完 全缓解者，另选择非恶性血液系统及其他系统恶 性疾病患者15例作为阴性对照组。其中将初诊组 外周血白细胞计数≥30×10⁹/L作为高白细胞组，将 白细胞计数＜30×10⁹/L作为非高白细胞组，初诊组 中高白细胞组32例，非高细胞组17例。 1.3 标本提取及制备

骨髓穿刺抽取骨髓液4 ml，用人外周血淋巴 细胞分离液分离出单个核细胞，分2管，分别采用 UNIQ-10柱式Trizol法提取总RNA、采用RIRA细胞 裂解液提取蛋白。另所有细胞系按照常规方法培 养于RPMI1640培养液，每3~4天传代一次，选取 处于对数生长期的细胞作为实验对象。 1.4 qRT-PCR检测USP22基因mRNA

取2 μgRNA反转录合成cDNA，进行PCR 扩增，应用SYBR® Select Master Mix 1-Pack试 剂盒(Applied Biosystem,Foster City,CA,USA) 和StepOne™Real-Time PCR System (Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)进行此实验，根据 StepOne™Real-Time PCR(Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)说明书进行。GAPDH基因作为内参 基因。人USP22和GAPDH 引物应用Primer Express version 2.0进行设计：USP22 mRNA引物：正义链 为5'-GGGAGGAGGCTCACCTCTAA-3'，反义链 5'-AAAACCATCAACTCGGGCCT-3',产物长度113 bp；GAPDH mRNA引物：正义链为5'-TGCCCTC AACGACCACTTTG-3'，反义链为5'-TCTCTCTTC CTCTTGTGCTCTTGC-3'，产物长度152bp，以上 引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

进行实时定量PCR时，USP22基因和GAPDH 在96孔板的不同孔中进行扩增，每孔的20 μl反应 体系中由Select Master Mix 1-Pack 10μl ,0.2 μM 的 正义链，0.2 μM 的反义链和25 ng的 cDNA构成， 无RNA酶余用水补足，每个样本设3个复孔。反应 参数：95℃ 10 min，95℃变性15 s，60℃退火/延 伸 1 min，共40个循环。设置溶解曲线判断是否 有非特异性的扩增和引物二聚体的出现。USP22 基因的相对表达量用2^-ΔΔCt计算，ΔΔCt=（Ct_USP22- Ct_GAPDH）实验组-（Ct_USP22-Ct_GAPDH）对照组。 1.5 Western blot检测USP22蛋白的表达

进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每次两块胶。将 50 μg溶解蛋白加入5% SDS凝胶中100 V电泳30 min进行浓缩，在10% SDS凝胶中120 V电泳70 min 进行分离。将胶转移至PVDF膜(BBI,Canada)， 200 mA并行转膜2 h。转膜结束后，胶和膜分别用 考马斯亮蓝和丽春红染色证明转膜成功。将膜浸 入封闭液中封闭1 h，分别加入USP22多克隆抗体 (EPITOMICS,USA) 、β-actin多克隆抗体（上海碧 云天科技有限公司）4℃孵育过夜。PBS-T洗膜三 次后，山羊抗兔二抗(BBI,Canada)25℃孵育2 h， 接下来，PBS-T洗膜三次后，根据说明书用ECL显 色法在X线片上对条带进行曝光。USP22蛋白条带 大概在60 kD处显色，β-actin蛋白大概在40 kD处显 色。对X线片进行扫描后，在电脑上通过图像处理 软件Image J进行图像分析。USP22蛋白的相对表 达量用USP22灰度值/β-actin灰度值表示。 1.6 初诊急性白血病患者的治疗情况

所有初诊急性白血病患者进行常规化疗方案 化疗，AML给予DA[柔红霉素(DNR)45~90 mg/m² 第 1~3天；阿糖胞苷(Ara-C) 100~200 mg/m² 连用7 天]或 IA[去甲氧柔红霉素(IDA)8~12 mg/m²第1～3 天；阿糖胞苷(Ara-C) 100~200 mg/m²连用7天] 方 案；ALL患者给予VDCLP[长春新碱（VCR）1.4 mg/m²，第 1、8、15、22 天；柔红霉素（DNR）40 mg/m²，第 1~3天；环磷酰胺（CTX） 750 mg/m²，第1、15天；左旋门冬酰胺酶(L-Asp) 6000 IU，第 11、14、17、20、23、26天；泼尼松 1 mg/kg连用 14天，第 15~28 天可减量1／3]方案，老年患者根 据患者情况给予剂量减量化疗，一疗程化疗后， 比较USP22表达与初诊白血病患者获得缓解情况的 关系。 1.7 统计学方法

应用统计学软件SPSS17.0分析。实验组和阴 性对照组之间的USP22基因和蛋白表达采用独立样 本t检验进行比较。显著水平用P值是否<0.05来确 定。 2 结果 2.1 实时荧光定量PCR结果

熔解曲线 USP22、GAPDH的熔解曲线峰值 单一 ，未见杂峰信号；USP22熔解温度为85℃， GAPDH熔解温度为85℃。表明PCR参数选择适 当，USP22、GAPDH反转录引物和扩增引物能够 扩增出片段，产物特异度较好，非特异产物对结 果影响较小。 2.2 急性白血病患者实时荧光定量PCR检测结果

结果显示，USP22 mRNA在Jurkat、HL-60、 K562、molt-4和NB4细胞系的表达量分别为25.61、 29.92、24.22、23.73、26.01。USP22 mRNA在初诊 组（33.90±9.58）、缓解组（1.81±0.53）白血病患 者USP22基因表达水平明显高于阴性对照组（1.05± 0.33），且差异均具有统计学意义(P<0.001)；初诊 组患者的USP22基因表达水平较缓解组患者明显增 高，差异具有统计学意义(P<0.001)；高白细胞组 （45.23±10.92）较非高白细胞组（26.73±6.12）的 急性白血病患者的USP22基因表达水平高，但是初 诊AML患者和初诊ALL患者之间USP22基因的表 达差异无统计学意义（P=0.531）。 2.3 Western blot检测结果

本组病例中，有些病例骨髓单个核细胞数目 不足，因此未进行本实验，最终初诊组包括28例初次诊断为急性白血病的患者（AML 17例、ALL 11例），其中高白细胞16例，非高白细胞12例； 缓解组包括15例诊断为缓解期急性白血病的患者 （AML10例、ALL 5例）；阴性对照组10例进行了 本实验。

结果显示，USP22蛋白在Jurkat、HL-60、 K562、molt-4和NB4细胞系的表达量分别为 0.69、0.78、0.64、0.44、0.49。初诊组（0.58± 0.15）、缓解组（0.10±0.03）表达明显高于阴性 对照组（0.05±0.02），差异均具有统计学意义 （P ＜0.001）；初诊组较缓解组白血病患者相比 表达明显增高（P＜0.001），高白细胞组（0.69± 0.16）较非高白细胞组（0.42±0.10）的急性白血病 患者的USP22基因表达水平高。但是初诊AML患 者和初诊ALL患者之间USP22蛋白的表达差异无统 计学意义（P=0.377）。从上述结果看，实时定量 PCR的结果与Western blot分析的结果基本一致， 见图 1。

图 1

Figure 1

图 1 Western blot检测USP22和 β-actin 蛋白的表达Figure 1USP22 and β-actin protein expressions detected by Western blot1,2: USP22 and β-actin protein expressions in initial diagnosis group;3,4: USP22 and β-actin protein expressions in remission group;5,6: USP22 and β-actin protein expressions in negative control group;7,8,9,10,11: USP22 and β-actin protein expressions in Jurkat,HL-60,K562,molt-4 and NB4 cell lines

U S P 2 2 m R NA中位表达水平为3 2 . 2 2 （12.25~61.02），总初次诱导化疗缓解率为 77.55%。按照初诊USP22 mRNA中位表达水平将 初诊AL患者分为高表达组（USP22 mRNA表达＞ 32.22）与低表达组（USP22 mRNA表达≤32.22）， 高表达组与低表达组初次诱导缓解率分别为 66.67% 、88.0%，差异有统计学意义（χ²=8.101， P=0.004），见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 USP22 的表达与初次诱导缓解率的关系 [例（%）] Table 1 Relationship between USP22 expression and remission rate of initial diagnosis before treatment[n(%)]

表 1 USP22 的表达与初次诱导缓解率的关系 [例（%）] Table 1 Relationship between USP22 expression and remission rate of initial diagnosis before treatment[n(%)]

USP22蛋白中位表达水平为0.57（0.23~1.05），总初 次诱导化疗缓解率为68.96%。按照初诊USP22蛋白中位 表达水平将初诊AL患者分为高表达组（USP22蛋白表 达＞0.57）与低表达组（USP22蛋白表达≤0.57），高表达 组与低表达组初次诱导缓解率分别为50%、86.67%，差 异具有统计学意义（χ²=4.392，P=0.036），见表 1。 3 讨论

USP22是泛素水解酶家族成员之一，泛素水解酶属半胱氨酸蛋白酶家族，其作用是将泛素与蛋白 底物分离开，以此来调控泛素化过程。hSAGA复合 体参与了MYC的靶基因的转录。USP22主要通过增 强C-MYC介导的基因转录，从而促进肿瘤增殖和生 长。通过RNA干扰下调USP22基因,能下调MYC介 导的靶基因转录,包括JPO1、cyclinD2、ODC、CAD 和MTA1。降低USP22表达可使高表达MYC的细胞增 殖减慢，停滞于G1期，克隆形成率下降^[2]，说明USP22 可以通过MYC调控的靶基因促细胞增殖、介导细胞 恶性行为^[9]。相关研究证实USP22可能通过BMI-1调 控的pRb(pRb/p16INK4a/cyclin D1)^[10]、p53(p14ARF/ Mdm²/P53)通路^[11]和PI3k/Akt/GSK3β^[12]介导细胞的恶 性增殖。此外USP22在核受体介导的基因调控、端粒 稳态维持、细胞周期调控等方面发挥着重要的生物 学功能。USP22作为一种新颖的预测转移和预后不良 的分子标记基因，已被证实在多种实体肿瘤的病理 发展过程中扮演一个重要角色，包括前列腺癌^[3]、乳 腺癌^[4]、肺癌^[5]、胃癌^[6]、大肠癌^[7]等,并且其表达程度 与肿瘤转移潜能、化疗耐药性及患者预后密切相关。

本研究发现，USP22 mRNA和蛋白在初诊急性白 血病患者中有表达，且较阴性对照组表达水平高，此 结果提示USP22基因可能参与了白血病的发生、发展 的过程。高白细胞患者USP22表达量较非高白细胞患 者表达量高，而高白细胞白血病是急性白血病的高危 类型，早期死亡率高，对化疗的反应不敏感，治疗缓 解率低，总体预后不良。同时我们观察了所有初诊急 性白血病患者的情况，一疗程的标准化疗后，分析获 得完全缓解和未缓解患者的信息。与高表达USP22患 者相比，低表达USP22的患者有较高的完全缓解率， 此结果提示了高表达USP22可能是急性白血病的预 后不良的因素之一。

总之，USP22基因作为“肿瘤细胞标志物”之一， 已引起诸多肿瘤学者的重视，不仅表达与多种肿瘤疾 病，并且与急性白血病治疗的预后有关。然而USP22 如何介导白血病的生发、发展等相关机制并不明确， 尚需进一步研究。 eig