小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)占原 发性支气管肺癌的10%~25%，其特点是恶性程度 高、生长迅速、侵袭力强，易出现远处转移，虽然 对放化疗敏感，但治疗完全缓解的患者在未来也几 乎无一例外地出现复发或转移。血行播散是SCLC 转移的重要途径，肿瘤细胞进入外周血即循环肿瘤 细胞( circulating tumor cells，CTCs)，在一定条件 下形成微转移灶，是肿瘤发生远处转移的早期事 件。因此，CTCs检测对SCLC的早期诊断、疗效评 估、监控复发转移和判断预后方面有重要意义 ^{[1, 2]}。 胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releasing peptide, ProGRP)在SCLC患者高表达，而在NSCLC患者中 不表达或低表达，在肺部良性疾病及健康人群中 不表达，成为SCLC比较理想的肿瘤标志物^[3]。外 周血ProGRP mRNA的检测可以作为CTCs存在的标 志。本研究采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RTPCR)法，以ProGRP mRNA为指标，检测SCLC患者 外周血中的CTCs，并与血清ProGRP蛋白检测进行 比较，探讨两者的临床意义。 1 资料与方法 1.1 资料

收集2012年4月—2012年9月间山东省肿瘤 医院初治的SCLC患者61例，均经病理组织学和 （或）细胞学证实。其中男43例，女18例；年龄 41~76岁，中位年龄60岁。临床分期按1973年美国 退伍军人医院分期标准：局限期(limited disease， LD )27例，广泛期(extensive disease，ED )34例。 卡氏评分均为60~90分，治疗前肝、肾功能及 血象正常。化疗方案多为EP(依托泊甙+顺铂)、 EC(依托泊甙+卡铂)，化疗2周期以上。所有患者 于第1次和第3次化疗前进行影像学检查，并根据 2009年美国国立癌症研究所实体瘤客观疗效评定 标准修订版RECIST1.1 ^[4]进行疗效评价，分为完 全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR )、稳定(stable disease,SD ) 和进展 (progressive disease,PD )。根据疗效分为化疗有效 组(PR+CR)、无效组(SD+PD)。 1.2 主要试剂

CanAg ProGRP EIA试剂盒为瑞典CanAg公 司；RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司；引物由上海生工 生物工程技术服务有限公司设计合成，序列为： ProGRP上游引物;5'-AAAGAGCACAGGGGAGTC TT C-3'，下游引物：5'-TCCTTTGCTTCTATGAG ACCCA-3'；内参β-actin上游引物：5'-TGGCACCC AGCACAATGAA-3'，下游引物：5'-CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAA GCA-3’。 1.3 标本采集及处理

于第1次和第3次化疗前采清晨空腹静脉血 2 ml，离心后吸取血清分装保存于-20℃冰箱冰冻 保存待检，禁止标本反复冻融及加热。同时取新 鲜EDTA抗凝血1.5 ml，使用QIAamp RNA Blood Mini Kit试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计下测 定RNA纯度和浓度，取OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8～2.1范 围内的标本进行反转录。RNA提取及反转录实验 中的塑料制品及实验用具均经0.1%DEPC水处理后 高压灭菌。 1.4 标本检测

ELISA法检测血清ProGRP浓度，严格按说 明书进行操作。ProGRP mRNA检测采用实时荧 光定量RT-PCR 法：RNA提取完成后，将RNA 反转录为cDNA，反应条件为37℃、15 min， 85℃、5 s。以cDNA为模板进行PCR扩增目的 片段ProGRP和β-actin。PCR反应体系为20 μl， 其中SYBRpremixEXTaq TMII 10 μl（TaKaRa DRR081S）、上下游引物各0.8 μl（10 μmol/L）、 ROX Reference Dye 0.4 μl、cDNA 2.0 μl、dH2O 6.0 μl，每个基因做3个复孔，于实时定量PCR仪 进行PCR反应，扩增条件为：95℃预变性30 s， 95℃变性5 s，60℃退火31 s，40个循环。读取Ct 值，首先按公式“ΔCt=Ct(ProGRP)平均值-Ct(β-actin)平 均值”分别计算治疗前和治疗后的ΔCt，其值表 示待测样本达到荧光阈值所用的PCR循环数较 内参达到荧光阈值所用PCR循环数的差，ΔCt值 与ProGRP mRNA的表达量呈负相关，即ΔCt值 增加，表示ProGRP mRNA 表达水平下降；再按 公式“ΔΔCt=ΔCt_治疗后-ΔCt_治疗前”得到“2^-ΔΔCt ”，代表 ProGRP基因相对表达量。 1.5 统计学方法

使用SPSS17.0 软件进行数据处理。所有数据 均用中位数和四分位间距表示。ELISA检测结果 经对数转换后成正态分布，方差齐性检验后的计 量资料比较采用独立样本t检验、配对t检验；计 数资料采用χ 2检验，小样本采取Fisher精确检验； ProGRP mRNA表达水平与血清ProGRP水平相关 性分析采用直线相关分析方法；治疗前后ProGRP mRNA表达水平及ProGRP浓度变化与客观疗效评 价的相关性采用Spearman等级相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 SCLC患者外周血ProGRP mRNA表达水平与临床病理因素的关系

SCLC患者外周血ProGRP mRNA表达水平与性 别、年龄无相关性，差异无统计学意义(P>0.05)； 而与原发肿瘤大小、临床分期及远处转移均有相 关性，其差异有统计学意义(P<0.05)。ED期患者 ProGRP mRNA表达水平明显高于LD期患者，有转 移患者的ProGRP mRNA表达水平较高，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 SCLC患者外周血ProGRP mRNA表达与临床病理因素之间的关系[中位数(四分位间距)] Table 1 Relationship between ProGRP mRNA expression and clinicopathological factors [Median(Inter Quartile Range)] Notes: SCLC: small cell lung cancer; ProGRP:pro-gastrin-releasing peptide; LD :limited disease; ED:extensive disease

表 1 SCLC患者外周血ProGRP mRNA表达与临床病理因素之间的关系[中位数(四分位间距)] Table 1 Relationship between ProGRP mRNA expression and clinicopathological factors [Median(Inter Quartile Range)]

61例SCLC患者化疗2周期后进行疗效评价： CR 2例、PR 40例、SD 13例、PD 6例；化疗有效 组42例、无效组19例。化疗有效组ProGRP mRNA 表达水平(ΔCt=7.63)明显低于化疗前(ΔCt=5.89)， 差异有统计学意义(P<0.01)；无效组化疗前后 ProGRP mRNA表达水平无明显变化(ΔCt化疗前=5.41: ΔCt化疗后=5.74)，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗 后ProGRP mRNA相对表达量(2^-ΔΔCt )在PR+CR组、 SD组、PD组分别为0.38、1.59、2.19，治疗前后 ProGRP mRNA相对表达量与影像学疗效评价显著 相关(r=0.671，P<0.001)，见图 1。

图 1

Figure 1

图 1 ProGRP mRNA表达水平变化与影像学评价的关系 Figure 1 The analysis of ProGRP mRNA expression and objective responses CR: complete response; PR: partial response; SD: stable disease; PD: progressive disease

血清ProGRP水平与性别、年龄无关(P>0.05)，与 肿瘤大小、临床分期及远处转移相关(P<0.05)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 SCLC患者血清ProGRP 水平与临床病理因素的关系[中位数(四分位间距)] Table 2 The relationship between clinicopathological factors and serum level of ProGRP in SCLC patients[Median(Inter Quartile Range)]

表 2 SCLC患者血清ProGRP 水平与临床病理因素的关系[中位数(四分位间距)] Table 2 The relationship between clinicopathological factors and serum level of ProGRP in SCLC patients[Median(Inter Quartile Range)]

化疗2周期后，SCLC患者血清中ProGRP的浓 度水平(54.33 ng/L)明显低于化疗前(602.67 ng/L)， 差异均有统计学意义(P<0.01)。治疗有效组血清 ProGRP (28.50 ng/L)明显低于治疗前(420.17 ng/L)， 差异有统计学意义(P<0.01)，而无效组化疗前后血 清ProGRP浓度无明显变化(1 201.83 ng/L、1 022.67 ng/L)，差异无统计学意义(P>0.05)。 2.5 外周血ProGRP mRNA表达水平与血清ProGRP浓度的相关性

采用直线相关的方法对外周血ProGRP mRNA 的ΔCt值和血清ProGRP蛋白进行相关性分析，结 果显示两者之间存在着直线负相关(r=-0.586， P<0.001)，见图2，间接说明ProGRP mRNA表达水 平与血清ProGRP呈正相关。

图2

Figure 2

图2 外周血ProGRP mRNA表达与血清ProGRP蛋白的相关性 Figure 2 The relationship between ProGRP mRNA expression and serum ProGRP

SCLC血行转移发生较早，肿瘤细胞血循环 微转移是肿瘤转移复发重要起始步骤，若能早期 检测肿瘤转移并及时治疗，可提高治疗效果和改 善患者预后。常规影像学检查方法对于微转移病 灶不能提供可靠的证据，RT-PCR方法是目前检测 微转移敏感度较高的方法，可在1×10⁶ ~1×10⁷个外 周血细胞中检测出单个肿瘤细胞。由于血液中有 RNA裂解酶，游离mRNA极易被降解，因此外周 血中检测到靶RNA则说明外周血中存在完整的肿 瘤细胞。选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是 否可靠的重要因素，而ProGRP mRNA是SCLC微 转移最常选择的靶RNA ^[3]。

本研究应用实时荧光定量RT-PCR法在SCLC患 者外周血中检测到ProGRP mRNA，间接提示CTCs 的存在。虽然在血液中检测到肿瘤细胞并不意味着 一定存在转移灶，但研究^{[1, 5, 6]}显示CTCs与肿瘤分期 及转移具有明显相关性。Tanaka等^[5]研究发现肺癌 患者CTC计数随着肺癌分期的增加而显著增加，Ⅳ 期患者CTC计数显著高于Ⅰ~Ⅲ期患者，有远处转移 的患者CTC计数显著高于无转移的患者。Hou等^[6]研 究同样表明，CTCs的存在与肿瘤分期存在明显的相 关性，ED期患者计数明显高于LD期。本研究结果 与文献报道结果一致，提示肿瘤分期越晚，侵袭性 越强，释放到外周血中的CTCs越多，发生血行转移 的可能性就越大。另外，本研究发现外周血ProGRP mRNA水平与血清ProGRP呈正相关，提示肿瘤负荷 增加，释放到外周血的肿瘤细胞及标志物水平同步 升高，因而，尽管血清ProGRP浓度高低只能提供肿 瘤原发灶的信息，而不能反应肿瘤转移及循环肿瘤 细胞的情况，但本研究显示ProGRP对SCLC的早期 诊断、监测病情、评估疗效和判定预后的价值与文 献^{[7, 8]}报道结果一致。

化疗是SCLC首选的治疗方法，监测化疗过程 中外周血CTC的动态变化，可反映肿瘤对化疗药 物敏感度，是目前评估化疗敏感度的重要方法。 目前众多研究^{[1, 2, 9, 10]}提示动态监测CTCs水平变化有 助于早期评估患者化疗疗效，对患者生存期有较 好的预测作用。本研究结果显示，化疗前后患者 ProGRP mRNA水平变化与疗效相关，化疗有效时 水平下降，无效或进展时不变或升高，化疗前后 患者ProGRP mRNA水平变化与化疗后影像学的应 答存在明显相关性，可作为预测肿瘤患者化疗效 果的指标。因此，定期检测并监测ProGRP mRNA 的变化，可及时判断治疗效果，提早发现疾病进 展，为个体化治疗方案选择提供依据。但治疗前 或治疗后CTCs水平较高的患者，延长治疗时间 是否有意义，值得进一步研究。血清ProGRP水 平检测，无论是治疗前水平对病情的评估，还是 治疗前后的水平变化与疗效的关系，均与ProGRP mRNA的结果一致，该指标检测简便易行，是否 能作为CTCs检测的间接指标，需要大样本的临床 观察证实。本组病例数偏少，随访时间尚短，关 于ProGRP mRNA作为CTCs的标志对SCLC患者疗 效评价和预后预测的价值尚需大规模、多中心的 随访研究进行验证。