手术、放疗和化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要 方法^[1]。化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时还杀死正 常细胞，引起明显不良反应。如何增强化疗药物的 抗肿瘤效果，同时减低其不良反应，是肿瘤化疗的 研究方向之一^[2]。肿瘤生物治疗，特别是肿瘤的免疫治疗，是目前肿瘤治疗的研究热点。肿瘤免疫治 疗调动机体的天然或特异性免疫反应，免疫效应细 胞或因子只杀死肿瘤细胞，而不伤害正常细胞^[3]。 化疗结合免疫治疗，比单独使用化疗和免疫治疗， 能明显提高肿瘤的治疗疗效,是肿瘤治疗的一个发展 方向^[4]。

氧化石墨纳米颗粒是由单个碳原子组成的薄 膜，其表面带负电荷且与pH值相关，大小通常小于 20 nm，较其他纳米颗粒有巨大的表面积。静脉注 射250 μg的氧化石墨纳米颗粒到小鼠体内，无明显 不良反应，表明其安全性较高。而且静脉注射的氧 化石墨纳米颗粒聚集在小鼠肿瘤周围。氧化石墨纳米颗粒曾被用于吸附5-氟尿嘧啶、Doxorubicin等化 疗药物，还用于吸附DNA，但使用氧化石墨纳米颗 粒吸附多肽和蛋白质的报道不多见^[5]。使用氧化石 墨纳米颗粒吸附5-氟尿嘧啶、 抗体和细胞因子治疗 恶性肿瘤,有可能比游离的5-氟尿嘧啶,抗体和细胞 因子产生较好的治疗效果。使用氧化石墨纳米颗粒 吸附化学物质如抗肿瘤药物、细胞因子、抗体的研 究主要为体外实验和动物实验，尚未见用于临床治 疗的报告。

我们使用氧化石墨纳米颗粒，分别吸附5-氟尿 嘧啶、干扰素γ和抗白介素10受体抗体，并在体外验 证氧化石墨纳米颗粒吸附的5-氟尿嘧啶、干扰素γ和 抗白介素10受体抗体的生物学活性。 1 材料和方法 1.1 氧化石墨纳米颗粒吸附5-氟尿嘧啶、干扰素和 抗白介素10受体抗体

氧化石墨纳米颗粒 (graphene oxide,GO)由澳 大利亚卧龙岗大学Kosta Constantinov 博士提供。 200 μl GO（3 mg/ml）与150 μl抗白介素10受体抗体 （6 mg/ml）和（或）10 μg干扰素充分混合后，放 置于4℃过夜。混合物12 h后用大量磷酸盐缓冲液 （PBS）洗涤。1 000 r/min离心5 min后，200 μl PBS 重悬，-80ºC冰箱储存。吸附于氧化石墨纳米颗粒上 的干扰素(GO/IFNγ)和抗白介素10受体抗体(GO/anti- IL10R)浓度分别用总蛋白定量，ELISA和Western blot电泳测定^[6]。

2 ml GO（3 mg/ml）与3 mg 5-Fu (Sigma,F6627) 充分混合后，放置于4℃过夜。混合物12 h后用大量 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。1 000 r/min离心5 min 后，200 μl PBS重悬，储存于-80ºC冰箱备用。吸附 于氧化石墨纳米颗粒中的5-Fu(GO/5-Fu)浓度使用 UV-VIS方法测定,浓度为0.03 mg/ml。 1.2 小鼠和细胞系

6~8周雌性C57BL/6小鼠购于澳大利亚动物研 究中心。所有的动物实验均经卧龙岗大学动物伦理 委员会批准。小鼠黑色素瘤B16细胞系、小鼠乳腺 癌4T1细胞系培养于含10%小牛血清DMEM培养液 中，5% CO2培养箱中培养。 1.3 抗体、细胞因子和其他试剂

抗白介素10受体抗体(货号BE0050)购于美国 BioXcell公司。Anti-MHCⅡ-FITC（11-5321-81）, anti-CD11c-APC（17-0114-81），Anti-CD86-PE （12-0861-81） IFNγ（14-8311-63）购于美国 Ebioscience公司。Anti-CD11c 磁珠 (130-052-001) 购 于德国MiltenyiBiotec公司。脂多糖(LPS、L3012)购 于美国Sigma公司。PI (00-6990-50)、 IL12p40 ELISA (88-7120-86)购于Ebioscience公司。 1.4 阳性分选小鼠脾脏CD11c+细胞

阳性分选小鼠脾脏CD11c+细胞参照文献^[7]，流 式细胞检测CD11c+细胞的纯度为80%。 1.5 5-Fu体外肿瘤细胞杀死实验

5×10⁵小鼠黑色素瘤B16细胞培养于含1 ml DMEM 培养液的24孔培养板 (Nunc公司) 中，24 h 后，加入不同剂量的5-Fu、GO/5-Fu。2、24、48 h 后，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化液消化 细胞，PI染色、 LSR Ⅱ流式细胞仪分析。 1.6 体外刺激小鼠脾脏CD11c+细胞

2×10⁵ CD11c+MHC Ⅱ+脾脏树突状细胞培养于 含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，分别用100 ng LPS,10 μg/ml 抗白介素10受体抗体和不同浓度 的干扰素γ刺激过夜。隔日收集上清液，用于检测 IL12p40。 1.7 ELISA检测细胞培养上清中IL12p40

ELISA检测细胞培养上清的IL12p40参照文献^[8]。 1.8 统计学方法

Two way student t test 用统计学分析软件Prism 5 分析，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 GO不抑制B16 肿瘤生长、不引起小鼠CD11c+MHCⅡ+细胞分泌白介素12

GO是由单个碳原子组成的薄膜,吸附抗白介素 10受体抗体后不规则集聚，见图1A 。

图 1

Figure 1

图 1 GO对B16肿瘤生长、树突细胞表达CD86的影响Figure 1Effects of GO on inhibition of B16 tumor growth and CD86 expression in dendritic cellsA: Left, Middle: GO,Electronic microscope (×50 000), Optical microscope (×400); Right: GO/anti-IL10R, Optical microscope (×400);B: Graphene oxide does not inhibit tumour growth. Left: Number of B16 tumor cells Middle: No of live cells; Right: FACS profile;C:CD86 expression by CD11c+ dendritic cells after GO stimulation

将1×10⁵ 小鼠黑色素瘤B16细胞培养于含1 ml DMEM 培养液的24孔培养板中。培养24 h,加入不 同剂量的GO。继续培养24 h后，用0.25% 胰蛋酶和 0.02% EDTA消化，计数后用PI染色，流式细胞仪检 测死亡和活细胞。结果表明，GO本身不造成小鼠 B16细胞死亡，即使剂量达到60 μg/ml,其细胞数量 和活细胞数与不加GO时相似，差异无统计学意义(P >0.05)，见图1B。2×10⁵小鼠CD11c+细胞培养在含1 ml DMEM 培养液的24孔培养板中，将不同剂量的 GO加入培养的细胞中，24 h后检测细胞表面CD86 的表达，见图1C。结果表明GO不刺激小鼠CD11c+ 细胞表达CD86，即使其浓度达到15 μg/ml。 2.2 GO/5-Fu抑制肿瘤细胞生长的能力

5×10⁵小鼠黑色素瘤B16细胞培养于含1 ml DMEM培养液的24孔培养板中。24 h后,加入 GO/5- Fu 5 μl,准备GO/5-Fu时加入PBS洗涤后的上清液 5 μl或5-Fu 3 μl (35 μg/μl) 。继续培养2、24、48 h后，用0.25% 胰蛋酶和0.02%EDTA消化细胞，计 数后PI染色，经流式细胞仪检测死亡和活细胞。 加入药物2 h后，各组细胞数量一致，差异无统计 学意义。24 h后，5-Fu和GO/5-Fu组的细胞数量明 显减少，且PI阳性细胞也明显增高 (P<0.05)；48 h 后，上述现象更加明显。上述结果表明，GO/5-Fu 有细胞毒性作用，上清在体外无杀死肿瘤细胞的 能力,5-Fu的确已经吸附在GO中，见图 2。我们进 一步检测了GO/5-Fu杀死B16肿瘤细胞的效果。结 果表明，GO/5-Fu杀死B16肿瘤细胞的能力与其剂 量呈正相关，见图 3。

图 2

Figure 2

图 2 GO/5-Fu 可以抑制B16肿瘤细胞生长Figure 2GO absorbed 5-Fu inhibits B16 tumor growth in vitro1: Untreated; 2: 5-Fu; 3: Supernatant; 4: GO/5-Fu; Upper panel: Number of B16 cells 2, 24, 48 h after 5-Fu, GO/5-Fu or supernatant from GO/5-Fu stimulation;Lower panel: Number of live B16 tumour cells 24 h after 5-Fu, GO/F-Fu or supernatant from GO/5-Fu stimulation

图 3

Figure 3

图 3 GO/5-Fu抑制B16肿瘤细胞生长与GO/5-Fu的剂量呈正相关Figure 3The effects of Melittin on proliferation of EPCs by MTT assayInhibition of B16 tumor growth by GO absorbed 5-Fu is correlated with GO/5-Fu dosage

使用对5-Fu更为敏感的小鼠乳腺癌4T1细胞。 5×10⁵小鼠4T1细胞培养在含1 ml DMEM 培养液 的24孔培养板中。24 h后,加入含同等量的5-Fu的 GO/5-Fu (0.1 μl) 和5-Fu (0.003 μg)。24 h后，用 0.25%胰蛋酶和0.02% EDTA消化细胞后计数并经PI 染色后用流式细胞仪检测。结果表明，GO/5-Fu组 比5-Fu组的活细胞显著减少(P<0.05)，含同样数量 5-Fu的GO/5-Fu杀死4T1细胞的能力远比5-Fu高， 见图 4。

图 4

Figure 4

图 4GO/5-Fu与5-Fu杀死肿瘤细胞效率比较Figure 4GO absorbed 5-Fu kills tumor cells more effi ciently than free 5-Fu1: Untreated; 2: GO/5-Fu; 3: 5-Fu; 24 hours after GO/5-Fu or free 5-Fu stimulation; Left: Number of 4T1 cells; Right: Number of live 4T1 cells

将干扰素γ和抗白介素10受体抗体分别吸附到 比氧化石墨纳米颗粒上并通过Western blot、ELISA 等方法确定其浓度^[13]。分离小鼠CD11c+树突状细 胞，将2×10⁵CD11c脾脏树突状细胞培养在含10% 小牛血清的RPMI培养液中，分别用100 ng LPS 和 GO、干扰素γ、抗白介素10受体抗体刺激过夜。第 二天收集上清用于检测IL12。结果表明，与对照 组GO/LPS相比，GO/干扰素γ，GO/抗白介素10 诱 导LPS刺激的小鼠CD11c+MHCⅡ+细胞分泌IL12 (P<0.05)，而且GO、干扰素γ、抗白介素10刺激LPS 刺激的CD11c+细胞分泌IL12有叠加作用，见图 5。

图 5

Figure 5

图 5GO吸附的IFNγ和Anti-10R抗体促使LPS刺激的 CD11c+细胞分泌IL12Figure 5GO absorbed IFNγ and Anti-10R antibodies promote IL12 secretion by LPS stimulated dendritic cells1:LPS/GO; 2: LPS/GO aIL10R; 3: LPS/GOIFNg; 4: LPS GO/aIL 10R IFNg; CD11c+ dendritic cells were stimulated with GO absorbed LPS, GO/LPS aIL10R, GO/LPS/IFNγ or GO/LPS/aIL10R/IFNγ overnight,IL12p40 from supernatants were measured by ELISA

我们使用氧化石墨纳米颗粒吸附5-氟尿嘧啶、 抗白介素10受体抗体和IFNγ，体外证明石墨纳米颗 粒吸附的5-氟尿嘧啶、抗白介素10受体抗体和IFNγ 有生物学活性。GO/5-Fu可以杀死B16，4T1肿瘤细 胞，而且杀死肿瘤细胞的效果比5-Fu本身更好。 GO/抗白介素10受体抗体，GO/IFNγ可以分别使LPS 刺激的小鼠树突状细胞分泌更多的白介素12，且GO/ IFNγ/抗白介素10受体抗体对促进LPS刺激的小鼠树突 状细胞分泌更多的白介素12有叠加作用。

肿瘤局部给药是提高恶性肿瘤治疗效果、减少治 疗药物，尤其是化疗药物不良反应的有效方法之一。 氧化石墨纳米颗粒静脉注射入小鼠体内后，聚集在肿瘤细胞周围^[9],我们的资料还发现，吸附于氧化石墨纳 米颗粒的抗白介素10受体抗体，在pH值为6～7.4的环 境下，仍能缓慢地从氧化石墨纳米颗粒中释放^[6]，提 示静脉或肿瘤组织周围注射GO吸附的抗癌药物或免疫 刺激因子，可以较长时间使药物停留在肿瘤组织周围 并维持在较高浓度,而在体内其他部位的浓度将远比 肿瘤组织中低。

肿瘤细胞在与机体的免疫系统不断斗争过程中， 形成了有助于肿瘤细胞生长的免疫微环境，使机体的 免疫系统不能够将肿瘤细胞清除^[10]。在小鼠肿瘤体内 注射Toll样受体配体CpG和抗白介素10受体抗体可以解 除肿瘤微环境的免疫抑制作用，促进小鼠肿瘤细胞的 清除^[11]。干扰素是杀死肿瘤细胞的重要细胞因子之一 ^[12]。我们用氧化石墨纳米颗粒吸附抗白介素10受体抗 体，发现该抗体在pH值为6~7.4情况下，缓慢从纳米颗 粒中释放，如果局部注射到肿瘤体内，抗白介素10受 体抗体在肿瘤组织的浓度将会保持在有效治疗浓度。

氧化石墨纳米颗粒吸附的5-Fu和抗白介素10受体 抗体较5-Fu、抗白介素10受体抗体本身的活性好，可 能是由于氧化石墨纳米颗粒吸附的5-Fu更容易被转运 到肿瘤细胞内。用氧化石墨纳米颗粒吸附的抗白介素 10受体抗体和LPS卵蛋白或等量的抗白介素10受体抗 体和LPS卵蛋白免疫小鼠。氧化石墨纳米颗粒吸附的 抗白介素10受体抗体诱导小鼠产生对卵蛋白的细胞毒 性T细胞的反应，比没有被氧化石墨纳米颗粒吸附的 抗白介素10受体抗体诱导小鼠产生对卵蛋白的细胞毒 性T细胞的反应明显提高^[6]。氧化石墨纳米颗粒吸附的 抗白介素10抗体很可能较抗白介素10受体抗体本身， 更容易接近抗议提呈细胞，故而提高了抗体效果。

肿瘤药物化疗并结合免疫治疗是近年来肿瘤治 疗的研发方向。过去以为化疗和免疫治疗两者相互拮 抗。认为化疗药物引起细胞凋亡且不伴有炎性反应， 导致免疫耐受。其次，淋巴细胞减少也是许多化疗药物的常见不良反应之一。但近来研究提示化疗和免疫 治疗结合使用有更好的抗癌效果^[1]。例如，胶质母细胞 瘤患者化疗结合树突状细胞免疫治疗后2年生存率比单 独化疗或免疫治疗高^[13]。化疗可以更多的暴露肿瘤抗 原，通过抗原提呈细胞将肿瘤抗原提呈给T细胞。而且 化疗后的肿瘤组织更有利于效应T细胞的肿瘤杀伤作 用。化疗后使用激活抗原提呈细胞的免疫治疗，可以更 好地清除小鼠肿瘤。研究发现，在致癌剂诱导小鼠乳腺 癌和纤维母细胞瘤模型中，Doxorubicin 治疗可以提高 肿瘤特异性CD8T 细胞的增殖，促进肿瘤特异性CD8细 胞在肿瘤组织中的浸润^[14]。GO吸附化疗药物和细胞因 子后，可以更好提高化疗结合免疫治疗的效率。

综上所述，我们用氧化石墨纳米颗粒吸附了化 疗药物5-Fu和免疫刺激因子，发现他们体外有生物活 性。如果局部用于肿瘤组织，有可能有较好的肿瘤治 疗作用。