食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一^[1]，在确 诊时，由于多数为中晚期，大部分已失去手术机 会。而单纯放疗在食管癌治疗中疗效较差，在晚 期患者治疗中尤为明显。热疗是通过加热使肿瘤 组织的温度达到40℃~44℃，引起肿瘤细胞生长阻 滞或死亡的一种治疗方式。除了对肿瘤细胞直接 的细胞毒效应，热疗还可以对放、化疗增敏，抑 制肿瘤的转移，提高机体的免疫力。本文旨在探 讨热疗在食管癌放疗方面的应用及其机制，为制 定合理的食管癌放疗策略，提高食管癌疗效提供 研究基础和理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料

人食管癌细胞株EC-1细胞由新乡医学院肿瘤 反转录分子生物学实验室提供。用含100 u/ml青霉 素、100 μg/ml链霉素和10% （V/V）胎牛血清的 RPMI1640培养液，于37℃、5% CO2孵箱中培养。 每24 h更换培养液。每48 h传代一次。

恒温循环水浴器（HX-1050)（北京博医康实 验仪器有限公司）；电热恒温水浴箱（HB3V21， Cu600)（上海医疗器械七厂)；恒温CO2细胞培养箱 （英国RSBionch公司)；倒置显微镜（EE 2000-U） （日本Nikon公司)，超净工作台（SW-CJ-1F）（苏 州净化设备有限公司) ，6 MV电子直线加速器（德 国西门子公司)，Epic) s-XL II型里流式细胞仪（美 国Beckman Coulter公司BX51/BX5）2系统显微镜 （日本Olympus公司），OLYMPUS直立光照照相 系统（日本Olympus公司）。 1.2 实验方法

采用平板克隆形成实验 实验分组分为4组:空 白对照组（O组）；单纯热疗组（H组）；单纯放 疗组（R组）；热疗+放疗组(HR组）。先热疗随即 予以放疗。热疗是将恒温孵育箱(温度波动±0.1℃) 温度调至43℃稳定一昼夜，次日将细胞培养皿瓶口 密封后放入恒温孵育箱中，加热30 min，热平衡5 min。放疗所有照射均在室温下照射，电子直线加 速器6 MVX线，剂量率为200 cGy/min，照射面积 23×16 cm，源轴距100 cm，培养瓶或培养皿下置1.5 cm组织补偿膜，机架角180°室温下照射。

取对数生长期生长的EC-1细胞，制成单细胞 悬液，计数并按梯度稀释分别接种于60 mm培养皿 中，接种24 h细胞贴壁后，行热疗处理热处理，再 将各组细胞培养皿正置，分别给予0、l、2、4、6、 8、10 Gy剂量照射，，继续放入孵育箱中进行培养 14天。培养14天后取出60 cm培养皿，弃培养液， PBS缓冲液清涤2遍，用甲醇固定，加用Gimsa液染 色20 min，计数显微镜下大于50个细胞的克隆数。 按以下公式计算存活分数(SF) =实验组每孔克隆数 /(每孔细胞种植数×贴壁率)×100%。 1.3 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 1.3.1 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期的EC-1细胞，细胞浓度调整为l×10⁵ /ml接种在6孔 培养板上，每板3 ml，接种后24 h予以下处理： 空白对照组（O组）、单纯热疗组（H组）、单纯 放疗组（R组）、热疗+放疗组(HR组)，热疗予以 43℃加热30 min，热疗后即行放疗，剂量率为200 cGy/min，照射剂量为2 Gy。处理结束后于37℃、 5%CO2的培养箱中再培养48 h，消化离心制成单细 胞悬液，以冷PBS洗涤2次。1 ml PBS打散离心管中 的细胞制成细胞悬液，加入5 μl核糖核酸酶RNASE (10 mg/ml)，置37℃水浴中消化1 h以去掉RNA，然 后马上放在冰浴中终止消化。加入50 μl碘化丙啶PI (l mg/ml)，30 min避光染﹙4℃﹚，400目筛网滤过 后，样品上流式细胞仪于488 nm处检测细胞DNA 含量，每份标本累计分析10⁴个细胞，应用Exppo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，用Multicycle AV分 析软件对DNA细胞周期拟合分析。 1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡

实验分组与处理同1.3.1，收集各组的EC-1细胞，PBS缓冲液洗 涤2次，调整细胞浓度为1×10⁶／ml，加入1 ml PI染 液，Single histogram statistic软件分析细胞凋亡率。 1.4 统计学方法

本研究采用t检验（两样本均数比较）和单因 素方差分析（多样本均数比较），实验数据以均 数±标准差（±s）表示，统计软件使用的是SPSS 17.0，检验水准为α＝0.05。 2 结果 2.1 平板克隆形成实验测定细胞放射敏感度

热疗作用于食管癌细胞照射后所形成细胞克 隆状态，见图 1。（以2 Gy照射剂量为例），热疗 联合放疗细胞克隆数明显少于单纯放疗组，使用 克隆形成实验检测热疗联合或不联合放射线对人 食管癌EC-1细胞的作用，计其存活分数，绘制细 胞存活曲线，见图2。通过单击多靶模型相关参 数，见表 1。热疗联合放疗组D0、Dq 、N分别为 2.07、0.241、1.308。放疗增敏比为1.059。HR组 与R组相比，细胞存活曲线肩变窄，斜率增大。表 明热疗对食管癌细胞有放射增敏作用。

图 1

Figure 1

图 1 不同处理组食管癌克隆形成情况 Figure 1 Colony forming state of different groups A : radiotherapy group (2 Gy);B:hyperthermia+radiotherapy group(2Gy)

图2

Figure 2

图2 食管癌EC-1细胞存活曲线 Figure 2 Survival curves of EC-1 esophageal cancer cell R:radiotherapy;HR:hyperthermia+radiotherapy

表 1(Table 1)

表 1 EC-1细胞照射后存活曲线的主要参数 Table 1 The main parameter of EC-1 cell SF curve after irradiation Note: -:control group

表 1 EC-1细胞照射后存活曲线的主要参数 Table 1 The main parameter of EC-1 cell SF curve after irradiation

为研究热疗对人食管癌EC-1细胞放射增敏效 应的可能机制，用流式细胞仪检测各组细胞经不 同处理后的细胞凋亡以及细胞周期分布的改变。

表 2(Table 2)

表 2 不同处理组细胞凋亡检测结果(±s) Table 2 Test results for apoptosis in different groups (±s) Note:*：compared with other groups,P<0.05;H:hyperthermia

表 2 不同处理组细胞凋亡检测结果(±s) Table 2 Test results for apoptosis in different groups (±s)

经不同处理48小时后各组细胞凋亡变化见表 2，空白对照组凋亡率为0.69%、单纯热疗组凋亡 率为0.78%，差异有统计学意义（P<0.05）。单 纯放疗组凋亡率为1.13%、热疗+放疗组凋亡率为 2.7%，其凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）。

不同处理48小时后各组细胞所占细胞周期比 例变化，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 不同处理组细胞周期结果(%，±s) Table 3 Test results for cell cycles in different groups(%，±s) Note: *:compared with other groups,P<0.05;O:control

表 3 不同处理组细胞周期结果(%，±s) Table 3 Test results for cell cycles in different groups(%，±s)

研究证实，热疗不仅对黑色素瘤 ^[2]等实体瘤化疗 有增敏作用，在脑胶质瘤 ^[3]、乳 腺 癌 ^[4]、宫 颈 癌 ^{[5, 6]}、肝 癌^[7]放疗也有增敏。我国在上世纪80年代热疗开始 在食管癌的应用研究。郭可锋等^[8]在研究中晚期食 管癌也发现热放治疗组的近期疗效（95.8％）明显 优于单纯放疗组（70.8％）。临床研究 ^{[9, 10]}发现在食 管癌热放治疗组明显优于单纯放疗组。

本实验中，根据单击多靶模型公式进行两组 细胞放射-生存曲线的拟合比较后发现，单纯照射 组经过热疗作用后的细胞D0值、Dq值、N值均减 小，热疗对人食管癌EC-1细胞放疗增敏[SER(D0)为 1.059,SER(Dq)为1.917]。上述结果提示：经热疗作 用后细胞对照射的平均致死剂量较单纯照射组降 低，肩区缩小，细胞亚致死性损伤修复能力减弱。 通过流式细胞术检测细胞周期及凋结果显示：热疗 使细胞阻滞在G₂/M期，S期细胞减少，从而使放射 敏感度增加。但幅度不大，最低才降至2.7％。可能 原因是热疗联合放疗后，细胞周期抑制基因p57表 达显著上调，而细胞周期促进基因cyclinB的表达受 到明显下调所致^[10]。热疗可以增加放射线诱导的凋 亡，但作用不明显。此外，在做细胞周期分析时发 现，热疗联合放疗后G₂/M期细胞比例降之最低， 达27.7％。细胞受到DNA损伤后，p53的激活常会 导致G₀/G₁期停滞，但食管癌EC-1细胞可能p53基因 突变，G₀/G₁期不受阻滞，甚至促进该期，从而使 G₀/G₁期细胞比例降低，细胞凋亡不明显，而缺乏 p53时则多引起G₂/M期停滞。

本研究实验显示：热疗对食管癌EC-l细胞均 具有明显增敏作用，其可能放疗增敏机制是通过 影响食管癌EC-l细胞周期，其次通过诱导细胞凋 亡，增强放射线对细胞的杀伤作用。