肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一^[1]， 目前位居癌症死因的第一位。迄今为止，除手术 外，化疗是最主要的治疗手段之一。木脂素是芝 麻中主要活性成分^{[2, 3]}，其中芝麻素占约木脂素一 半含量，在体内表现为较强的生物学活性^[4]。本实 验主要研究芝麻素的体外抗肺癌及诱导细胞凋亡 的作用并揭示其可能的抗肿瘤机制，为芝麻素开 发成抗肿瘤辅助用药或抗肿瘤新药提供进一步的 实验和理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料

人肺腺癌A549细胞株（由中国医学科学院购 置，由本科室体外传代培养）。肺腺癌A549细胞 株培养于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培 养液中,置37℃、5%的CO2培养箱中培养，实验时 取对数生长期细胞。 1.2 方法 1.2.1 MTT检测

测定开始实验前24 h进行细胞换 液，取对数生长期人肺腺癌A549细胞，消化制备 成单细胞悬液，低倍镜下进行细胞计数后，接种 于96孔板中，细胞浓度为1×10⁶个/毫升。细胞贴壁 后，每孔分别加入药物20 μl，使实验组芝麻素终 浓度达10、20、40 、60、80 μg/ml，并另设空白组 和对照组，分别培养24、48、72 h后，每孔分别加 入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h后，小心 弃上清液，每孔分别加入二甲基亚砜（DMSO） 150 μl，轻轻振荡10 min后用酶标仪在492 nm处 测定吸光度（A）值。计算细胞生长抑制率及药 物抑制率，并利用NDST软件计算半数抑制浓度 （IC₅₀）。计算公式：肿瘤细胞增殖抑制率（%） ＝１- [加药孔A值/对照孔A值]×100%。 1.2.2 倒置显微镜观察

取对数生长期人肺癌 A549细胞，0.25%胰酶常规消化，吹打均匀，制备 成浓度为1×10⁶个/毫升的细胞悬液，接种于75 ml 培养瓶中，贴壁生长后加入芝麻素40 μg/ml，另设 对照组，CO2培养箱培养24、48、72 h后，利用倒 置显微镜进行细胞形态学观察，并拍照记录。 1.2.3 HE染色

取对数生长期人肺腺癌A549细 胞，制备成浓度为1×10⁶个/毫升细胞悬液，接种于 6孔板中，每孔细胞2 ml，设空白对照组（不加药 物）、芝麻素40 μg/ml组，细胞贴壁牢固后，分别 加入相应药物，在CO2培养箱培养48 h后，按照常 规染色法进行HE染色观察。 1.2.4 流式细胞术检测细胞周期

取对数生长期 的人肺腺癌A549细胞，用0.25%胰酶消化，吹打 均匀，制备成1×10⁶个/毫升细胞悬液,置于100 ml 的培养瓶中培养，加入芝麻素40 μg/ml，另设立对 照组（不加药物），放入CO2恒温细胞培养箱， 放入CO2恒温细胞培养箱，继续培养48 h后，收集 细胞悬液，按以下步骤进行：冷PBS (pH:7.2~7.4) 缓冲液洗涤，1000 r/min，离心3 min，2次；加 入2 ml冷PBS缓冲液，制备成单细胞悬液；加入4 ml预冷的70%乙醇固定，4℃保存过夜；将细胞悬 液1 000 r/min,离心5 min，小心弃上清液；冷PBS 缓冲液2 ml 洗涤，1 000 r/min，离心5 min，2次； 加入RNA酶，37℃水浴30 min；加碘化丙锭(PI)染 色液混匀，4℃避光30 min；上机检测，检测凋亡 率，查看变异率，分析细胞周期分布等情况。 1.2.5 Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡

取对 数生长期的人肺腺癌A549细胞，用0.25%胰酶消 化，吹打均匀，制备成1×10⁶个/毫升细胞悬液，置 于100 ml的培养瓶中培养，加入芝麻素40 μg/ml， 另设立对照组（不加药物），放入CO2恒温细胞培 养箱，继续培养48 h后，收集细胞悬液，按以下步 骤进行：将待测细胞的培养液用移液器吸入到15 ml试管中，用冷PBS洗涤两次，PBS洗液亦收集到 试管中。加胰酶消化；用收集的弃液和PBS洗涤液 终止消化，混匀分别收入到各自的离心管中，300 r/min，离心5 min弃上清液；冷PBS（1~2）ml洗 涤2次，300 r/min，离心5 min弃上清液；用冷PBS 洗涤各组待检细胞2次，并在1×binding buffer中重 悬细胞浓度为1×10⁶ 个/毫升。吸取100 μl的细胞(1 ×105)至试管中；加入5 μl的Annexin V试剂（BD） 和5 μl的碘化丙锭(PI)（BD）（在室温下进行，上 机前添加PI）。轻柔混匀后避光室温下孵育15 min 后每管加入400 μl结合缓冲液，立即上流式细胞仪 分析，检测细胞凋亡。 1.2.6 流式细胞术检测Bcl-2、Bax凋亡蛋白表 达

取对数生长期的人肺腺癌A549细胞，用0.25% 胰酶消化，吹打均匀，制备成1×10⁶个/毫升细胞悬 液，置于100 ml的培养瓶中培养，加入芝麻素40 μg/ml，另设立对照组（不加药物），放入CO2恒 温细胞培养箱，继续培养48 h后，收集细胞悬液， 按以下步骤进行：将待测细胞的培养液用移液器 吸入到15 ml试管中，用冷PBS洗涤两次，PBS洗 液亦收集到试管中。加胰酶消化；用收集的弃液 和PBS洗涤液终止消化，混匀分别收入到各自的 离心管中；300 r/min离心5 min弃上清液；冷PBS（1~2）ml洗涤2次，300 r/min离心5 min弃上清 液；收集各组待检细胞，加入冷PBS （1~2）ml， 轻柔混匀；300 r/min离心5 min，弃上清液；加入 1 ml 1×的细胞通透液（按说明书细胞通透液1:9稀 释）。室温孵育10 min；500 r/min离心5 min，倒 掉上清液；加入特异性包内荧光抗体：对照管加 IgG1 FITC(20 ul)或IgG1 PE(20 μl)，检测管加Bcl-2 FITC 20 μl（BD）或bax PE20 ul（BD），轻柔震 荡；室温避光孵育30 min；加入2 ml的PBS缓冲 液，轻柔震荡混匀；500 r/min离心5 min，倒掉上 清液；加入0.5 ml PBS，混悬，以流式细胞术检测 Bcl-2、Bax凋亡蛋白表达。 1.2.7 免疫细胞化学染色

细胞爬片参考体外细 胞培养方法中的爬片方法，实验操作按照SABC试 剂盒即Caspase3、8、9试剂盒（武汉博士德）的 说明，参照实验程序，略加修改。光学显微镜下 观察，并拍照记录。结果判断：细胞内观察到清 晰的棕色颗粒为阳性细胞。Caspase在细胞质中呈 现黄色颗粒为阳性表达，以细胞轻微着色或未着 色判定为阴性，每张爬片在显微镜下用10×40放大 倍率观察10个视野，每个视野中，分别计算出阳 性细胞数和细胞总数，并计算细胞阳性表达率。 细胞阳性表达率（%）=阳性细胞数/细胞总数× 100%，免疫组织化学染色中，以已知阳性物质的 肺癌组织切片为阳性对照，以PBS缓冲液代替单抗 工作液为阴性对照。 1.3 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，数 据资料以均数±标准差表示，各组之间均数比较采 用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 MTT检测细胞生长增殖情况

MTT结果显示芝麻素10、20、40、60、80 μg/ml分别对肺癌A549细胞均有抑制作用，随时 间延长而逐渐增强，组间比较差异有统计学意义 （P<0.01），见表1。我们以接近半数抑制浓度 （IC₅₀）为参考，观察不同浓度的药物对肺腺癌 A549细胞的抑制作用，48 h结果显示芝麻素40 μg/ ml组较对照组，抑制率明显（P<0.01），最接近 IC₅₀。

表1(Table 1)

表1MTT法检测各组药物不同时间段的细胞抑制率 Table 1 MTT detected cell growth inhibiting rate of each groups in different time periods Notes:24 h:*:different concentration groups a compared to control group,P＜0.01; 48 h:#:different concentration groups a compared to control group,P＜0.01;72 h: +:different concentration groups a compared to control group,P＜0.01

表1 MTT法检测各组药物不同时间段的细胞抑制率 Table 1 MTT detected cell growth inhibiting rate of each groups in different time periods

倒置显微镜见对照组细胞形态为多角形或梭 形，细胞密集，贴壁牢固，细胞间距小，细胞体 积大，细胞膜完整；胞质丰富且分布均匀，饱满而 透亮，可见核分裂相；芝麻素作用24 h组，细胞间 距变大，细胞数量较对照组有所减少，体积略缩 小，胞质凝缩，折光率增强，细胞膜完整，贴壁牢 固，部分癌细胞呈逐渐变圆趋势，可见部分凋亡细 胞；芝麻素作用48 h组，细胞数明显减少，细胞稀 疏，细胞凋亡明显，细胞间隙变大；芝麻素作用 72 h组，细胞数量明显减少，凋亡增多，细胞数量 明显减少，细胞轮廓增强，变圆的细胞数量更加增 多，贴壁细胞很少，视野中细胞凋亡增加。 2.3 HE染色情况

HE染色形态学观察对照组细胞形态呈不规则 多角形，细胞排列致密，细胞间空隙少，胞质丰 富，细胞核染色明显，细胞核中可见多个核仁， 核分裂相多见；芝麻素作用24 h组细胞形态不规 则，细胞排列较疏松，视野中可见部分凋亡细 胞；芝麻素作用48 h组肿瘤细胞表现为核浓缩，胞 质浓缩减少，体积缩小，呈圆形或不规则形，核 染色质浓缩或染色质块形成，染色体被染成深蓝 色，视野中可见凋亡细胞；芝麻素作用72 h组可见 细胞排列疏松，胞质浓缩，变圆的细胞较对照组 更多，视野中可见较多的凋亡细胞，见图1。

图1

Figure 1

图1 对照组人肺腺癌A549细胞和40 μg/ml芝麻素作用不同 时间的细胞形态 Figure 1 The cellular morphology of human lung adenocarcinoma cell line A549 and different time after 40μg/ml sesamin treatmentA:control group;B:24 h after 40 μg/ml sesamin treatment;C:48 h after 40 μg/ml sesamin treatment;D:72 h after 40 μg/ml sesamin treatment

40 μg/ml芝麻素作用于肺腺癌A549细胞48 h 后，与对照组相比，其细胞分布周期发生了明显 变化，表现在G期细胞明显减少，多数细胞阻滞在 S期，见表2。由于采用特殊的设门技术，细胞周 期中并没有出现典型的亚二倍体峰，即凋亡峰。

表2(Table 2)

表2各浓度芝麻素作用A549细胞48小时细胞周期、凋亡率及变异系数变化 Table 2 The rate of cell cycle and apoptosis and coefficient of variation in human lung adenocarcinoma cell line A-549 of 48h after different concentration sesamin treatment Notes:G0/G1 stage:*:compared to control group,P＜0.01;S stage;#:compared to control group,P＜0.01;G2/M stage:+:compared to control group,P＞0.05;apoptosis rate:$:compared to control group,P＜0.01;coefficient of variation were less than 7.0 in all groups,controled in normal variation range,all numbers were a valid date and were acceptabie

表2各浓度芝麻素作用A549细胞48小时细胞周期、凋亡率及变异系数变化 Table 2 The rate of cell cycle and apoptosis and coefficient of variation in human lung adenocarcinoma cell line A-549 of 48h after different concentration sesamin treatment

Annexin V/PI检测细胞早期凋亡结果和对照组 相比，芝麻素干预组凋亡明显，与对照组相比， 有显著差异，见图2和表3。流式细胞仪检测凋亡 蛋白Bcl-2及Bax结果示与对照组相比较，芝麻素 干预后，Bcl-2蛋白的表达降低，而Bax蛋白的表达升高，Bcl-2/Bax比值降低，与对照组相比，差 异有统计学意义，见图3、4和表3。

图2

Figure 2

图2 Annexin V/PI检测细胞凋亡Figure 2 Cell apoptosis detected by Annexin V/PI stainingA: control group; B:experiment group

表3(Table 3)

表3 检测芝麻素干预组细胞抑制率(%) Table 3 Inhibitory rates to cells were detected in sesamin treatment(%) Notes:#:compared to control group,P<0.01;$:compared to control group,P＜0.01;*:compared to control group,P＜0.01

表3 检测芝麻素干预组细胞抑制率(%) Table 3 Inhibitory rates to cells were detected in sesamin treatment(%)

图3

Figure 3

图3 流式细胞仪检测凋亡蛋白Bcl-2表达Figure 3 Bcl-2 expression detected by flow cytometryA1,A2: control group; B1,B2:experiment group

图4

Figure 4

图4 流式细胞仪检测凋亡蛋白Bax表达Figure 4 Bax expression detected by flow cytometryA1,A2: control group; B1,B2:experiment group

经免疫细胞化学染色后，在光学显微镜下观 察，和对照组相比，芝麻素干预组较发生显著改 变，表达增高。与对照组相比，有明显的差异， 见图5~7、表4。

图5

Figure 5

A:control group;B:24 h after 40 μg/ml sesamin treatment 图5 对照组人肺腺癌A549细胞和40 μg/ml芝麻素作用48 h Caspase-3的表达(SABC法 ×400) Figure 5 The expression of Caspase-3 in human lung adenocarcinoma cell line A549 and 24 h after 40 μg/ml sesamin treatment(SABC ×400)

图6

Figure 5

A:control group;B:24 h after 40 μg/ml sesamin treatment 图6 对照组人肺腺癌A549细胞和40 μg/ml芝麻素作用48 h Caspase-8的表达(SABC法 ×400)Figure 6 The expression of Caspase-8 in human lung adenocarcinoma cell line A549 and 24 h after 40 μg/ml sesamin treatment(SABC ×400)

图7

Figure 7

A:control group;B:24 h after 40 μg/ml sesamin treatment 图7 对照组人肺腺癌A549细胞和40 μg/ml芝麻素作用48 h Caspase-9的表达(SABC法 ×400)Figure 7 The expression of Caspase-9 in human lung adenocarcinoma cell line A549 and 24 h after 40 μg/ml sesamin treatment(SABC ×400)

表4(Table 4)

表4 芝麻素作用48 h后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达(%) Table 4 Expression of Caspase-3,8,9 in 48 h after sesamin treatment(%) Notes:*:compared to control group,P＜0.01

表4 芝麻素作用48 h后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达(%) Table 4 Expression of Caspase-3,8,9 in 48 h after sesamin treatment(%)

细胞凋亡是在一定的生理或病理条件下主动 的遵循自身程序结束其生命的过程^[5]，故又称为程 序性死亡（programmed cell death,PCD）。近年来研究发现，各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方 式是促进肿瘤细胞的凋亡，通过对细胞凋亡的相 关研究，为肿瘤治疗提供了新的思路及靶点，诱 导肿瘤细胞凋亡成为肿瘤治疗的一条新途径^[6]。文 献表明^[7]，肿瘤治疗机制之一可能是在肿瘤细胞中 诱导凋亡，而各种细胞凋亡阈值的不同造成了治 疗效果的不同。凋亡诱导剂己经应用于肿瘤的治 疗，并且展示了其广阔而乐观的应用前景^[8]。国 内外学者已相继证实芝麻素对人类淋巴样白血病 Molt4B细胞^[9]、胃癌KATOⅢ细胞^[10]、小鼠肝癌Ⅱ 22细胞^[11]及S180肿瘤细胞^[12]均具有增殖抑制生长 作用。凋亡诱导作用是常规抗肿瘤治疗包括放射 线和化疗药物发挥作用的一个主要途径。

本实验中，采用MTT法测得芝麻素对肺腺癌 A549细胞有很好的抑制作用，我们以接近半数抑 制浓度（IC₅₀）为参考，采用相同条件下检测芝麻 素来观察对肺腺癌A549细胞的抑制作用，结果显 示，48 h芝麻素的IC₅₀为40 μg/ml，芝麻素对肺腺 癌A549的最大抑制率为71.06%。利用倒置显微镜 及HE染色观察到，随着药物浓度的增加细胞凋亡 特征性形态逐渐明显，提示芝麻素具有抑制肿瘤 细胞增殖及诱导凋亡作用。

本实验经流式细胞术分析结果显示，芝麻素 对人肺腺癌细胞有凋亡诱导效应，同时，肺腺癌 细胞周期产生了影响，细胞周期结果分析显示， 芝麻素处理过的细胞大部分阻滞在S期，考虑芝麻 素抑制了A549细胞的分裂，并通过启动凋亡机制 阻止肿瘤细胞恶性增殖。

Annexin V-FITC与PI双染荧光标记法是区别早 期凋亡和晚期凋亡的较可靠的常用方法之一。在 肿瘤的基础与临床研究中，Annexin V-FITC与PI 双染荧光标记可以协同MTT检测细胞凋亡情况， 便于上市的药物或化合物的药理和毒理分析、新 的抗肿瘤药物的筛选、抗肿瘤药物IC₅₀剂量确定、 抗肿瘤药物干预或联合干预的疗效评判以及新的 诱导肿瘤细胞凋亡机制研究等。实验显示：芝麻 素干预组出现早期凋亡细胞。提示芝麻素在早期 就具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用，推测 芝麻素参与肿瘤细胞脂质代谢，改变A549细胞膜 双层脂质镶嵌模型的完整性与通透性，导致细胞 膜及线粒体膜上Ca²⁺泵的活性异常，致使细胞内 Ca²⁺增多（钙超载）、线粒体内Ca²⁺减少，从而激活线粒体凋亡途径及细胞内ROS水平表达，引起氧化应激反应，诱导细胞凋亡。

细胞凋亡的实现主要通过两种通路，即内源 性通路和外源性通路，均最终导致Caspase-3的 活化，切割底物产生凋亡效应。本实验采用免 疫组织化学法以及流式细胞术对凋亡相关蛋白 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9以及Bcl-2/Bax 蛋白进行检测。结果显示芝麻素作用肺腺癌A549 细胞48 h后Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3活 性与阴性对照组比较均显著增高，芝麻素可能对 细胞凋亡的内源性通路有上调的作用，芝麻素 诱导肿瘤细胞凋亡可能与其激活了Caspase-3、 Caspase-8和Caspase-9有关。Bcl-2/Bax是Bcl-2家 族两个具有代表性的重要成员，凋亡通路受到抑 制时会有Bcl-2过度表达，而Bax的过度表达时使 Caspase-9活化并引发Caspase的级联反应，进而 下游的Caspase-3的激活促进线粒体通路诱导细胞 凋亡^[13]。本实验中，实验组Bcl-2阳性表达率明 显下降（P<0.01），而Bax阳性表达率明显升高 （P<0.01），结合线粒体通路的凋亡机制，考虑 芝麻素诱导凋亡可能是通过抑制信号转导通路上 的关键酶来实现的，通过下调Bcl-2和上调Bax影 响细胞凋亡的线粒体通路；Bcl-2/Bax比值降低 （P<0.01），芝麻素可能通过改变Bcl-2和Bax的平 衡，诱导Bax表达，从而抑制Bcl-2表达，进而诱导 A549细胞凋亡，这可能是芝麻素抗肿瘤作用的机 制之一。

综上所述，芝麻素可使人肺癌A549细胞株细 胞在细胞增殖周期的静止期聚集，从而干扰细胞 周期的进程抑制肿瘤细胞的增殖生长。芝麻素诱 导凋亡机制可能是通过下调bcl-2，上调Bax蛋白 的表达，Bcl-2/Bax比值降低，激活了Caspase-3、 Caspase-8和Caspase-9，从而影响凋亡通路实现。 根据实验结果，可初步判断芝麻素对人肺癌A549 细胞株的细胞周期及凋亡通路有影响，其机制可能 是芝麻素作用于人肺癌A549细胞株的凋亡相关基 因调控来实现。这些结果显示芝麻素在临床治疗肺 癌或辅助治疗肺癌方面具有一定潜力，并为临床用 药的开发提供了实验依据。