放疗和分子靶向治疗是非小细胞肺癌的重要 治疗手段，但针对EGFR的靶向治疗只有小部分人 受益，且易耐药。有研究显示，吉非替尼与放疗 联用可增加肿瘤细胞凋亡率，主要机制同厄洛替 尼相似，抑制EGFR与DNA-PK的结合^[1]。EGFR 单克隆抗体C225与放疗的协同作用比较明确，其 机制是抑制了放疗后活化的EGFR进入核内激活 DNA-PK进行的DSB修复^[2]。本实验选取A549细 胞，EGFR为野生型；H1975细胞，EGFR为双重突 变（L858R/T790M）作为研究对象^[3]，分析吉非替 尼对含有不同状态EGFR的NSCLC细胞是否有放射 增敏效应及其可能的机制。 1 材料与方法 1.1 材料

人NSCLC细胞株A549由同济医院妇产科国 家重点实验室惠赠; NCI-H1975购于中国医学科学 院基础医学研究所基础医学细胞中心。实验药品 吉非替尼由英国阿斯利康公司惠赠，称重研磨溶 于DMSO，终浓度为10 mmol/L，分装后-20℃保 存备用。主要试剂：Anti-phospho-Histone H2A.X （Ser139），clone JBW301 （Millipore公司）； Mouse EGFR（14C8）：sc-81450（Santa Cruz公 司），Lamin B1 polyclonal anti-body （Biovision公 司）。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

人NSCLC细胞株A549和NCI-H1975 采用含10%灭活胎牛血清RPMI1640培养液，于 37℃、5%CO₂、相对湿度90%的细胞培养箱中培 养，隔天换液，细胞每4~5天传代一次。细胞呈贴壁 生长，取对数生长期细胞进行实验。 1.2.2 MTT法检测

吉非替尼作用A549\HA1975细胞的IC₅₀值及细胞增殖抑制率 配制0.5 mg/ml的MTT 溶液，采用0.22 μm的滤膜过滤除菌，4℃避光保 存。接种培养细胞，药物处理组加入吉非替尼的 终浓度分别为0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、 5.0、10、50、100 μmol/ml，每孔重复3次。每孔 加10%DMEM 100 μl，同时每组设一空白对照孔 （仅加PBS，没有接种细胞）置37℃ 5%CO₂培养 箱内培养。吉非替尼作用24 h后，每天取培养细胞 一板，每孔加MTT 100 μl，置培养箱内继续培养 4 h。取出培养板吸弃培养液，同时每孔加入150 μl DMSO。置脱色摇床上振摇15 min，使结晶物充 分溶解。在酶标仪上595 nm波长处检测各孔OD值 （吸光度），纪录结果。实验重复3次，取3次实 验结果的平均值作为实验结果。按下列公式计算 肿瘤细胞增殖抑制率：肿瘤细胞增殖抑制率（%） ＝[1－(药物处理组OD值-空白对照组OD值)/(细胞 对照组OD值-空白对照组OD值)]×100% 1.2.3 细胞照射及实验分组

室温于同济医院肿 瘤中心直线加速器（瑞典ELEKTA-precise）室， 源皮距100 cm，机架角度180°，6 MV-X线照射， 培养皿/24孔板/培养瓶底部垫置1 cm有机玻璃板。 2株细胞A549和H1975均分别分为2组：单纯X线照 射组、X线+吉非替尼组，前者进行单纯 X 线照 射，后者在10 μmol/L 吉非替尼作用 24 h 后再进 行 X 线照射。 1.2.4 克隆形成实验

常规消化细胞，计数，稀释，接种不同细胞数于60 mm直径培养皿中培养。 细胞贴壁后，单纯X线照射组更换新鲜培养液，X 线+吉非替尼组改为含吉非替尼浓度为10 μmol/L的 培养液作用24 h，分别接受0 、1、 2、3、 4、6、 8 Gy单剂量照射，每个剂量点设3个平行样本。照 射后培养10~14 d，PBS漂洗后用甲醇固定20 min， 0.1%结晶紫染色15 min，室温自然干燥。低倍显微 镜下计数≥50个细胞的克隆数。以0 Gy组计算克 隆形成效率（plating efficicy,PE），计算各个剂量 下的细胞存活率（survival fraction,SF），PE=（0 Gy剂量下集落数/细胞接种数）×100%，SF=某一 剂量照射组细胞形成的克隆数/（该组细胞种植数× PE），根据LQ模型SF=exp(-αD-βD2)拟合曲线计算 得到SF2，重复3次。 1.2.5 免疫荧光法

收集对数生长期细胞，调整 细胞悬液浓度为1×10⁵/ml,接种于24孔板，使细 胞在盖玻片上贴壁生长，以4 GyX线照射，X线 +吉非替尼组以10 μmol/L吉非替尼提前24 h预处 理；取照射后0、15、30、45、60 min细胞，PBS洗，1%多聚甲醛10 min，70%酒精10 min固定； 0.2%Triton X-100，10 min破膜；PBS洗3遍，5% 山羊封闭血清室温下封闭10 min；加入一抗1:100 （γ-H₂AX），18 h，4℃；PBS洗3遍，TRITC-II抗 1:50，1 h，37℃；Hoechst33342染核，浓度0.005 mg/10 ml,避光孵育15 min，PBS洗，甘油封片，固 定至载玻片上，避光保存，激光共聚焦显微镜观 察照相（日本Olympus），显微镜图像分析软件计 数亮点（美国Image-pro plus）。 1.2.6 免疫印记法

以4GyX线照射铺满瓶底80%~ 90%的细胞，X线+吉非替尼组以10 μmol/L吉非替 尼提前24 h预处理，取照射后0、15、30、60 min 细胞(5×10⁶)~(1×10⁷)个／毫升，提取细胞质、细 胞核蛋白进行蛋白定量（BCA蛋白浓度测定试剂 盒，Pierce，NO.2161297），分装保存于-80℃。 制备5%浓缩胶，8%分离胶，以60 μg蛋白上样， 电泳，先180 mA转膜120 min，再350 mA转膜90 min，5%脱脂奶粉室温封闭90 min，EGFR 1:500稀 释4℃孵育过夜，PBS洗，HRP-Ⅱ抗1:2,000稀释室 温孵育2 h，PBS洗，ECL室温5 min，暗室胶片曝 光。扫描胶片，凝胶成像灰度定量系统（美国Bio- Rad）对蛋白条带进行灰度分析。 1.3 统计学方法

各组实验均重复 3 次，数据取均数，实验数 据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，免疫印记 结果采用重复测量资料方差分析，其余实验结果 采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 MTT检测IC₅₀及细胞增殖抑制率

吉非替尼对A549、H1975细胞增殖的抑制作 用呈剂量依赖性，其抑制A549细胞增殖IC₅₀值是30 μmol/L，抑制H1975细胞增殖IC₅₀值是27 μmol/L。 不同浓度吉非替尼对A549、H1975细胞增殖抑制 率，见图 1。结合本课题组前期实验^{[4, 5]}，吉非替尼 的半衰期及本实验结果选取实验浓度10 μmol/L。

图 1

Figure 1

图 1 吉非替尼对A549和H1975细胞增殖的抑制率 Figure 1 Inhibition rate of Gefi tinib on the growth of A549 and H1975

用Sigmaplot软件拟合A549、H1975细胞剂量 生存曲线，以放疗剂量为横坐标，SF值取对数作 为纵坐标，结果显示X线+吉非替尼组A549细胞相 比单纯X线组生存曲线有明显差异，两条曲线分 开较大，见图 2，X线+吉非替尼组A549的SF2值 明显小于单纯X线组（单纯X线组：α＝0.2983， β＝0.0537，SF2＝0.4833；X线+吉非替尼组：α＝ 0.3354，β＝0.1097，SF2＝0.3475）。而H1975细胞，X线+吉非替尼组和单纯X线组的生存曲线无明显 差异（单纯X线组：α＝0.2804，β＝0.1441，SF2 ＝0.3207；X线+吉非替尼组：α＝0.2812，β＝ 0.1527，SF2＝0.3094），见图 3。

图 2

Figure 2

图 2 A549细胞生存曲线 Figure 2 Survival curve of A549 cell dose

图 3

Figure 3

图 3 H1975细胞生存曲线 Figure 3 Survival curve of H1975 cell dose

激光共聚焦显微镜观察经4 GyX线照射后不 同时间点各组细胞核内γ-H₂AX亮点情况，蓝色为 细胞核，绿色亮点为γ-H₂AX亮点，各组细胞均在 15 min时细胞核内开始出现绿色亮点，在30 min时 细胞核内绿色亮点最明显，60 min后开始消失；A549细胞X线+吉非替尼组比单纯X线组各时间点 绿色荧光更明显，见图 4A，而H1975细胞X线+吉 非替尼组对比单纯X线组各时间点无明显差别，见 图 5A。每组随机选取30个细胞，用Image-pro plus 软件计数亮点，比较相同时间点X线+吉非替尼组 与单纯X线组γ-H₂AX亮点平均值，A549细胞X线+ 吉非替尼组比单纯X线组30、45、60 min时γ-H₂AX 表达明显增高，见图 4B；而H1975细胞X线+吉非替尼组相比单纯X线组30、45、60 min时γ-H₂AX表 达则无明显差异，见图 5B。

图 4

Figure 4

图 4 放疗后A549细胞中γ-H2AX免疫荧光结果 Figure 4 Fluorescence of γ-H2AX in A549 cells after irradiationA:immunostaining for confocal micros-copy testing for nuclear γ-H2AX foci of A549 cells after 4 Gy X ray; B:analsis of A549 cells nuclear γ-H2AX foci,*:X ray +Gefi tinib group vs.X ray group,P＜0.001

图 5

Figure 5

图 5 放疗后H1975细胞中γ-H2AX免疫荧光结果 Figure 5 Fluorescence of γ-H2AX in H1975 cells after irradiationA:immunostaining for confocal micros-copy testing for nuclear γ-H2AX foci of H1975 cells after 4 Gy X ray; B:analsis of H1975 cells nuclear γ-H2AX foci,*:X ray +Gefi tinib group vs.X ray group,P30min=0.108,P45min=0.123,P60min=0.070

A549细胞单纯X线组EGFR在放疗后有入核情 况，从放疗后15 min开始EGFR在胞核中表达逐渐 增多，到60 min时条带达最深，而胞质中EGFR表 达随时间呈递减趋势，说明4 Gy放疗后EGFR从胞质进入胞核，见图 6A；X线+吉非替尼组EGFR绝 大部分在胞质中表达，核内EGFR表达很少，且 条带无递增或递减变化。采用凝胶成像灰度定量 系统计算各条带的灰度值，做成柱状图，分别对 胞质、胞核内EGFR表达的两组数据进行重复测量 资料方差分析，差异有统计学意义（P胞质=0.043,P 胞核=0.004），见图 6B。结果表明A549细胞在放疗 后60 min内，在相同的时间点，X线+吉非替尼组细胞核EGFR表达均少于单纯X线组，可能是由于 吉非替尼通过某种途径阻止EGFR放疗后入核。 H1975细胞单纯X线组和X线+吉非替尼组EGFR在 各时间段均在胞质中表达，且胞质中条带无递增 或递减变化，胞核中无EGFR条带，见图 7A。采用 凝胶成像灰度定量系统计算各条带的灰度值，并 做成柱状图，分别对胞质、胞核内EGFR表达的两 组数据进行重复测量资料方差分析，差异无统计 学意义（P胞质=0.288,P胞核=0.623），见图 7B。结果 表明H1975细胞在放疗后60 min内，在各相同时间 点，单纯X线组和X线+吉非替尼组EGFR表达无差 异，且EGFR在胞核中表达明显少于胞质。

图 6

Figure 6

图 6 A549细胞EGFR的表达水平 Figure 6 The expression of EGFR in A549 cellsA:Western blot testing for cytoplesm and nuclear EGFR of A549 cell after 4Gy X ray;B:the densitometric of EGFR expression of A549cell

图 7

Figure 7

图 7 H1975细胞EGFR的表达水平 Figure 7 The expression of EGFR in H1975 cellsA:Western blot testing for cytoplesm and nuclear EGFR of H1975 cell after 4Gy X ray;B:the densitometric of EGFR expression of H1975 cell

放射线可直接或间接作用于DNA，导致DNA 损伤，其中DNA双链断裂（DNA double strand break，DSB）是最致命的，DSB的修复方式主要 有两种：同源重组（homologous recombination， HR）和DNA非同源性末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）。HR主要在低等生物如酵母 细胞中起作用，或在人类等哺乳动物细胞的晚S期 和G2/M期发挥作用，主要由ATM蛋白主导，居于 从属地位；NHEJ修复在哺乳动物细胞中居于主要 地位，由DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）主导 ^[6]。DNA-PK由调 节亚单位Ku蛋白二聚体（包括Ku80和Ku70亚单 位）及催化亚单位DNA-PKcs（DNA-PK catalytic subunit）组成。当DSB产生后，Ku80和Ku70亚单 位迅速形成异源二聚体，与受损DNA末端结合， 激活DNA-PKcs，引导XRCC4和DNA-LigaseⅣ组 成复合体，最后由DNA-LigaseⅣ定位并连接断裂 的DNA双链末端完成修复^[6]。

外源性化学、物理及生物性物质所致的DSB 都可能会使组蛋白H2AX发生快速磷酸化，形成 γ-H₂AX。γ-H₂AX的形成在DNA的DSB中不仅起到 损伤的标志性作用，而且在DNA的DSB修复中具 有连接的作用 ^[7] 。由于γ-H₂AX的数量与DNA损伤 的数量存在一一对应的关系，因此，γ-H₂AX可以 作为低剂量电离辐射衡量肿瘤放疗敏感度的指示 因子^[8]。

EGFR的活化有两种形式：自身形成同二聚 体，在受到某些因素如表皮生长因子 (epidermal growth factor，EGF)刺激，或基因突变致构象改 变情况下被激活；与HER家族其他成员（主要是 HER2和HER3）形成异二聚体，在受到刺激的情 况下被激活。EGFR激活后将磷酸化胞内端的特异 性酪氨酸残基，活化胞内的下游通路，如Ras/Raf/ MAPK和PI3K/AKT通路，发挥调节细胞凋亡、生存、增殖和有丝分裂等作用^[9]。Dittmann等^[10]发现 EGFR除了通过上述信号转导通路以外，还有一 种直接入核的途径：放射线除了直接导致DSB， 还能使细胞中和细胞间的水电离，产生大量氧自 由基，细胞外的氧自由基作用于细胞膜上的一些 膜受体如EGFR，EGFR活化后直接通过胞质进入 胞核，与DNA-PK结合，激活DNA-PK的催化亚基 DNA-PKcs，进行受损DNA修复。

放射线引起的EGFR入核与scr激酶激活EGFR 进入细胞质膜微囊相关。Scr激酶分别在Y845残 端激活EGFR和Y14残端激活caveolin-1，两者激活 后形成复合物进入细胞质膜微囊，包含有EGFR 的微囊通过微管转运至高尔基复合体/内质网，并 融合为内质网膜。EGFR存在于易位子Sec61复合 体中，并可以被其释放进入胞质。Sec61易位子 广泛存在于内质网和内质网/高尔基复合体过渡区 域，在蛋白合成期将分泌蛋白和跨膜蛋白插入内 质网。通过PKCε途径EGFR在T654残端磷酸化, 并与核转运蛋白α和β结合，这一过程使EGFR通 过细胞核孔进入细胞核^[11]。而与核转运蛋白结合 的先决条件是负荷蛋白出现核定位位点（nuclear localization site,NLS），Lin等^[12]证实了EGFR序 列中该位点的存在及其功能，并且EGFR磷酸化的 T654残端正好位于该EGFR核定位位点。

本实验选取A549和 H1975细胞作为研究对 象，旨在探讨吉非替尼对此两株细胞是否有放疗 增敏作用，其机制是否同C225，即抑制放疗后活 化的EGFR直接进入核内激活DNA-PK进行的DSB 修复^[3]。

根据克隆形成实验，计算SF值绘制剂量生存 曲线，发现A549细胞X线+吉非替尼组各剂量点细 胞存活率及SF2值均低于单纯X线组，说明前者放 疗后发生增殖性死亡的细胞多于后者，吉非替尼 能增加A549细胞的放疗敏感性。而H1975细胞X线 +吉非替尼组和单纯X线组SF2值并无明显差异， 吉非替尼对细胞株H1975无明显放疗增敏效应。

我们用免疫荧光技术观察以γ-H₂AX焦点形成 为特征的DNA双链断裂，通过激光共聚焦荧光显 微镜观察放疗后不同时间点细胞核内γ-H₂AX的表 达，并比较γ-H₂AX亮点平均值，发现A549细胞两 组均可观察到放疗后细胞核内γ-H₂AX的表达，且 在放疗后30 min达到高峰，60 min后逐渐消失，X 线+吉非替尼组的γ-H₂AX亮点在各时间点均明显 多于单纯X线组，这说明了吉非替尼使A549细胞 放疗后DSB形成增多，表现出放疗增敏作用。而 H1975细胞，两组γ-H₂AX亮点的变化及持续时间 无明显差异，说明放疗后两组DSB基本相同，吉 非替尼对H1975细胞无放疗增敏作用。

本实验通过Western blot检测放疗后两株细胞 EGFR入核情况，结果与激光共聚焦荧光显微镜 所观察到的一致。 A549细胞单纯X线组在放疗后 60 min内胞质EGFR表达随时间减少，胞核EGFR 表达随时间增多，X线+吉非替尼组EGFR大部分 在胞质中表达，细胞核内很少。Dittmann 等^[10]前 期研究发现野生型EGFR肺癌细胞A549受X线照射 后,迅速入核与胞核内DNA-PK结合,进行DNA损伤 修复，出现放射抵抗。结合本实验结果分析，吉 非替尼可能是通过抑制放疗后A549细胞EGFR入核 与DNA-PK结合，从而阻止受损DNA进行修复， 产生放疗增敏作用。Tanaka等^[13]报道，吉非替尼 与厄洛替尼的作用机制也许不同，因为他们未观 察到A549细胞加药组放疗后胞质及胞核内EGFR 表达的变化。产生不同结果的原因可能与加药浓 度高低有关，本实验吉非替尼的浓度为10μmol/L， 而Tanaka的研究^[13]中浓度仅为1μmol/L。与此同 时,H1975细胞单纯X线组和X线+吉非替尼组EGFR 均在胞质中表达，没有观察到放疗后入核情况，且 各时 间点无趋势差异，组间也无差异。Das等^[14]研 究发现，具有L858R + T790M 双重突变的H1975 细胞对放射线相对敏感，且放疗后在胞核中未检 测到EGFR的表达。本实验结果与之相似，由此 推测H1975细胞对放射线的敏感度不受吉非替尼 影响，原因与H1975细胞具有双重突变的EGFR 在两种条件下均不入核，无法与核内DNA-PK结 合完成DNA损伤修复相关。此外,吉非替尼通过 与ATP竞争，结合于EGFR-TK胞内端的催化区 域(EGFR结构域中高度保守的ATP结合位点),阻 止EGFR的自磷酸化及下游的信号传导,亦可影响 A549细胞修复。而H1975细胞EGFR发生二次突变 T790M,Kobayashi^[15]和Pao等^[3]研究显示T790残基位 于EGFR催化区域的ATP结合位点，该位点是吉非 替尼和厄洛替尼的关键作用点。当该点的苏氨酸 被甲硫氨酸替换后,出现两种药物结合到此位点的 空间阻碍现象,可见吉非替尼对H1975细胞作用甚 微。

综上所述，吉非替尼是否还通过其他途径影 响A549细胞放疗敏感度；达到增敏效果需要多大 的用药浓度；对其他不同状态的EGFR是否有放疗 增敏作用；能否将EGFR作为放疗增敏的靶点应用 于临床，以上问题还需进一步验证。