上皮性卵巢癌发病隐匿，发现时多为晚期，而 且治疗效果差，63%的患者确诊已为晚期（Ⅲ~Ⅳ 期），75%的患者在初治后的两年内易复发^[1]，广 泛性肿瘤细胞减灭术和多疗程化疗是卵巢上皮癌 的基本治疗原则。其中以铂类为基础的联合化疗 是卵巢癌治疗的重要组成部分，而肿瘤细胞多药 耐药性和化疗药物的不良反应，常导致化疗的失 败。寻找新的、低毒性的、有效杀灭肿瘤细胞并对 基础化疗药有增敏的药物迫在眉睫。二氢青蒿素 (dihydroartemisinin，DHA)是一种青蒿素类药物中 活性较强的衍生物，是青蒿素类药物在体内的主要 活性代谢产物。近年来研究发现，DHA除可抗疟疾 外，在体内、外均具有抗肿瘤作用，与其他青蒿素 类衍生物相比具有更强的抗肿瘤活性^[2]。本研究以 人卵巢癌SKOV3细胞为对象，观察二氢青蒿素对该 细胞系的体外抑制作用。 1材料与方法 1.1 材料与仪器

人卵巢癌SKOV3细胞，购于中国医学科学院 肿瘤细胞库。DHA购自中国药品生物制品检定所 （以DMSO助融）。RPMI1640培养液和DMSO购自 Salarbio公司；胎牛血清购自北京全世金生物技术有 限公司；MTT购自美国Sigma公司；流式凋亡试剂盒 购自KeyGEN 公司；反转录试剂盒购自康为试剂有限 公司；Bcl-2、Bax引物购自南京金斯瑞生物科技有限 公司。流式细胞仪购自BD FACSCalibur；酶标仪购 自美国Beckman公司；CO2 培养箱购自美国Thermo公司；PCR 仪购自美国Bio-RAD 公司。 1.2 方法 1.2.1 药物配置

二氢青蒿素用DMSO溶解配制 成100 mmol/L的母液,使DMSO终浓度<0.1%，过 滤，-20℃保存，用之前均用RPMI1640配成终浓度。 1.2.2 细胞培养

将人卵巢癌SKOV3细胞培养在含 100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的10%胎牛血清的 RPMI1640培养液中，37℃、5% CO2饱和湿度条件 下培养，当细胞长至80%~90%，用0.25%胰蛋白酶 消化传代，取对数生长期细胞进行实验。 1.2.3 细胞增殖抑制试验（MTT法）

取对数生长 期的细胞接种于96孔板，将细胞浓度调为1×10 5个/毫升，每孔200 μl细胞数1×104个细胞培养24 h贴壁 后加入适当浓度药物，药物浓度组为二氢青蒿素 （5、10、20、40、80 μmol/L），各浓度各设计5个 复孔，空白对照组加入等体积含0.1%DMSO的培养 液，37℃、5% CO2饱和湿度下培养24、48、72 h， 弃上清液，每孔中加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl继 续避光孵育4 h，终止培养。加样器小心吸去上清 液，每孔加DMSO 150 μl，震荡10 min。在酶标仪上 测490 nm处吸光值（OD值），记录结果。抑制率 =(1-OD实验组/1-OD对照组)×100% 。采用SPSS16.0 统计软件计算药物的半数抑制浓度( IC50值)。重复 实验3次，取其平均值。 1.2.4 Annexin V/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋 亡率

取不同浓度组的DHA（空白对照组0 μmol/L、 低浓度组5 μmol/L、中浓度组20 μmol/L、高浓度组 80 μmol/L）对数生长期的细胞，以每孔（1~5）×10 6 密度种植于6孔板。细胞贴壁后，吸弃上清液，对照 组和加药组处理24、48、72 h后收集所有悬浮及贴 壁细胞，每样本细胞数约为1×10 6个，1 000 r/min离 心5 min，弃去培养液。加入冷的PBS洗涤两次，2 000 r/min离心5 min。用500 μl Binding Buffer重悬细 胞，然后用5 μl标记溶液(FITC-Annexin V和PI加入 到Binding Buffer中，终浓度均为1 μg/ml)，室温下避 光孵育10~15 min。在流式细胞仪上测定检测凋亡率 （早期凋亡、晚期凋亡及坏死）。实验重复3次。 1.2.5 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

按实 验室常规操作提取细胞总RNA，并制备cDNA。 在Taq酶的作用下，进行扩增。扩增程序为94℃变 性30 s，54.5℃，退火30 s，72℃延伸1 min,35个 循环。所得的扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳 (120 V，30 min)，凝胶成像系统(Bio-Rad公司)成 像,用Band Leader软件定量分析产物条带的吸光 度值。实验用的引物：Bcl-2引物序列为5'-ATCC ATTATAAGCTGTCGCA-3'（正向引物）和5'-CG GTTCAGGTACTCAGTCAT-3'（反向引物）；Bax 引物序列为5'-GCTCTGAGCAGATCATGAAGA-3 （正向引物）5'-CCATGTTACTGTCCAGTTCGT-3'(reverse primer）；内参（h-actin）引物序列为5'- CGGGAAATCGTGCGTGAC -3'（正向引物）和5'- TGGAAGGTGGACAGCGAGG -3' （反向引物）。 所有实验都重复3次。 1.3 统计学方法

实验数据均以x±s表示。采用SPSS 16.0统计程 序，以t检验分析样本均数间的差异，以P<0.05为差 异有统计学意义。 2 结果

2.1 DHA对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制的作用

不同浓度及时间的DHA作用于卵巢癌SKOV3 细胞后，细胞生长速度呈下降趋势，并且呈现较明 显的时间及浓度依赖性。其中在较低浓度组（5、10 μmol/L）的48 h内对比中，抑制率生长稍微缓慢，抑 制率上升空间为4.3%、6.9%，在其72 h起抑制率上 升幅度为14.6%及9.2%，且其48~72 h的上升幅度明 显高于24~48 h上升幅度（6.8%、6%）。而同一时间 的中、高浓度组（20、40、80 μmol/L）抑制率上升 均较快，为10.4%~16%之间，而在此浓度组的不同 时间的抑制率中，24~48 h抑制率上升幅度较48~72 h抑制率上升的幅度有着明显的差异，24~48 h上升 的幅度为17.2%~24.7%，而48~72 h上升的幅度仅为 4.4%~9.7%。同时，在此实验结果中可以看到，各个 时间的浓度组与对照组之间相比差异均具有统计学 意义（F=10.297，P﹤0.05）。不同浓度的DHA(5、 10、20、40、80 μmol/L)作用24、48、72 h后，IC₅₀分 表1 MTT法检测DHA对SKOV3细胞增殖的抑制作用(n=5,x±s)别为117、35.677、23.382 μmol/L，见表1。

表1(Table 1)

表1MTT法检测DHA对SKOV3细胞增殖的抑制作用(n=5,x±s) Table 1 The inhibition of dihydroartemisinin on proliferation of SKOV3 cells by MTT (n=5,x±s) Notes：*:P﹤0.05,IR:inhibition rate

表1 MTT法检测DHA对SKOV3细胞增殖的抑制作用(n=5,x±s) Table 1 The inhibition of dihydroartemisinin on proliferation of SKOV3 cells by MTT (n=5,x±s)

Annexin V/PI双染色法将凋亡早晚期的细胞以 及死细胞区分开来，取不同浓度组的DHA [ 0（对 照组）、5 、20、80 μmol/L] 在不同的时间段（24、 48、72 h）作用于卵巢癌SKOV3细胞后，细胞凋 亡率上升，并且呈现明显的时间及浓度依赖性。 根据统计学数据，除去24 h 5 μmol/L浓度组以外， 各个浓度组与对照组比较差异均有统计学意义 （F=122.232，P﹤0.05），各时间的浓度组与对照 组之间差异有统计学意义，并且各个浓度组在不 同的时间阶段均有统计学意义（5 μmol/L：one-way ANOVA，F=34.056,P=0.001；20 μmol/L one-way ANOVA，F=37.429,P=0.000；80 μmol/L one-way ANOVA，F=45.509,P=0.000），差异具有统计学意 义。5 μmol/L随着时间的延长，其抑制率上升幅度 增大，其48~72 h为24~48 h 的2倍左右，而中、高浓 度组（20、80 μmol/L）时间上抑制率的上升幅度刚 好与低浓度组相反，其24~48 h的上升幅度为48~72 h的2倍左右。同时，流式细胞仪结果显示不同浓 度组（0、5、20、80 μmol/L）作用SKOV3细胞24 h 后，其凋亡率分别为（11.450±1.702）%，（14.383± 1.705）%，（24.827±4.145）%，（48.550±1.654）%， 随浓度的增高而升高，差异有统计学意义(one-way ANOVA; F=132.132,P=0.000)，见图1、表2。

图1

Figure 1

图1 Annexin V/PI双染色法检测不同浓度二氢青蒿素24 h诱导SKOV3细胞凋亡的结果图Figure 1 Assessment of SKOV3 cell apoptosis induced by DHA of different concentrations for 24 h by Annexin V/PINotes:A:control group;B:5 μmol/L;C: 20 μmol/L;D:80 μmol/L

表2(Table 2)

表2 FCM检测DHA诱导SKOV3细胞的凋亡率(n=5,x±s) Table 2 Effects of DHA on the apoptosis rate of SKOV3 cells by FCM (n=5,x±s) Notes: *:P﹤0.05 vs. control；a: P﹤0.05 vs.different time periods

表2 FCM检测DHA诱导SKOV3细胞的凋亡率(n=5,x±s) Table 2 Effects of DHA on the apoptosis rate of SKOV3 cells by FCM (n=5,x±s)

根据Band Leader软件分析，不同浓度组二氢青 蒿素(0、5、20、80 μmol/L)作用于SKOV3细胞，各 DHA浓度组Bcl-2吸光度值与对照组相比较呈下降 趋势,差异具有统计学意义（P﹤0.05），各浓度Bax 吸光度值与对照组相比较明显增高,差异有统计学意 义(P﹤0.05)，见图2、表3。

图2

Figure 2

图2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products A: h-actin, Bcl-2 and Bax level in control group:B:expressions of h-actin, Bcl-2 and Bax after SKOV3 cells treated with Dihydroartemisinin(5 μmol/L);C:expressions of h-actin, Bcl-2 and Bax after SKOV3 cells treated with Dihydroartemisinin(20 μmol/L);D: expressions of h-actin, Bcl-2 and Bax after SKOV3 cells treated with Dihydroartemisinin(80 μmol/L)

表3(Table 3)

表3二氢青蒿素对SKOV3细胞Bcl-2和Bax表达的影响(x±s,n=3) Table 3 Effects of DHA on gene expression of Bcl-2 and Bax in SKOV3 cells (x±s,n=3) Notes:*:P﹤0.05vs.control group

表3 二氢青蒿素对SKOV3细胞Bcl-2和Bax表达的影响(x±s,n=3) Table 3 Effects of DHA on gene expression of Bcl-2 and Bax in SKOV3 cells (x±s,n=3)

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，死亡率居于妇 科恶性肿瘤之首^[3]。卵巢癌化疗药物对人体不良反 应较大，且复发率较高，寻求高效低毒的治疗用药 是必经之路。青蒿素(Artemisinin)是我国药学工作者 1971年从菊科植物黄花蒿(Artemisiaannal)叶中提取 分离到的一种具有过氧基因的倍半萜内酯化合物， 具有清热解毒，抗肿瘤、抗菌、抗疟，增强免疫等 药理作用，临床上已用于治疗脑型疟、恶性疟^{[4, 5]}， 青蒿素类药物具有较强的抗肿瘤活性作用^[2]，二氢 青蒿素(DHA)是一种青蒿素类药物中活性较强的衍 生物，是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产 物，近年来各种研究发现，DHA在体内、外具有抗 肿瘤作用,与其他青蒿素类衍生物相比具有更强的 抗肿瘤活性^[6]。相关研究表明，二氢青蒿素可以通 过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期，诱导肿瘤细胞凋 亡，抑制肿瘤血管生成，Fe²⁺介导产生氧自由基的 细胞毒作用，耐药性逆转，从而提高肿瘤细胞对放 化疗的敏感度起着抑制肿瘤生长的作用。

本实验结果表明，DHA对SKOV3细胞生长的抑 制随浓度的升高和时间的延长而增强，24、28、72 h的IC₅₀值分别为117、35.677、23.382 μmol/L，提示 DHA一定程度上可抑制SKOV3细胞的生长。一定浓度的DHA可抑制卵巢癌SK0V3细胞增殖，诱导细胞 凋亡，并表现出时间和浓度依赖性。低浓度组及中、 高浓度组对于细胞的抑制率方面又有着一定程度上 的差异性，低浓度组时间依赖性比高浓度组较强， 而高浓度组对于低浓度组而言，随着时间的推移， 其抑制细胞生长的幅度有着较明显的下降趋势，是 由于药物依赖性所致还是药效已经达到饱和值或者 是否已产生耐药性，需要进一步的论证。因此，如何 在这些浓度中寻找到一个较佳值，使其在相对短的 时间促进癌细胞的凋亡，需要进一步的实验论证。

卵巢癌的发生发展不仅是细胞增殖异常的结 果，也可能与细胞凋亡失衡有关。本研究通过流式 细胞仪检测可以看出，不同浓度的DHA在不同的时 间段作用于卵巢癌SKOV3细胞后，细胞凋亡率有一 定程度的上升，并表现出一定的量效和时效关系。 同时，低浓度组较高浓度组的时间依赖性更明显，这 一结果可以表明，高浓度组可能在较短的时间内抑 制细胞的增殖，细胞抑制之后的维持期是否继续使 用此药物维持高浓度来抑制细胞的增殖，是否可以在中、高浓度组作用于细胞24或48 h后，采用低浓度 组维持药物作用，其抑制率是否相同，单一药物是 否具有一定程度的耐药性，都有待进一步的研究。 线粒体参与细胞凋亡的发生、发展及调控过 程。有研究表明，线粒体膜上Bcl-2表达水平的增高 抑制线粒体中细胞色素c的释放，从而抑制肿瘤细 胞凋亡。Bax可直接结合Bcl-2抑制其抗凋亡作用， DHA能有效升高细胞内促凋亡蛋白Bax，同时下调 抗凋亡蛋白Bcl-2 ^{[7, 8, 9, 10]}。同时，研究表明 ^[11]，内质网 应激可参与细胞凋亡，本实验也表明，DHA可以通 过下调Bcl-2基因表达，上调Bax基因的表达来促进 细胞的凋亡。而DHA在线粒体通路与内质网应激中 是否存在相关性以及相关网，我们将进一步研究。

综上所述，二氢青蒿素作为一种中药成分，一 定程度上能抑制肿瘤细胞增殖，有可能成为新型辅 助化疗药物。在卵巢癌方面，二氢青蒿素一定程度 上可以降低卵巢癌细胞的凋亡率，但其在体内实验 中是否同样可以降低肿瘤的生长或者抑制肿瘤的生 长，有待进一步考证。在卵巢癌基础抗肿瘤药物联 合使用时，对于二氢青蒿素对抗癌药是否有协同增 敏作用，成为化疗药物增敏剂；能否提高基础化疗 药物顺铂、卡铂的疗效以及有效率，抑或逆转肿瘤 细胞的耐药性方面，也有待进一步研究。