卵巢癌恶性程度高，死亡率位居妇科肿瘤 之首。75%患者确诊时已是晚期，多伴有腹腔等 远处转移，5年生存率约为25% ^[1]。上皮间质转化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤侵 袭转移中发生的重要特征^{[2, 3]}。在卵巢癌中，EMT 的进程也被证实与肿瘤进展及转移密切相关^{[4, 5]}。 E-cadherin不仅是EMT进程的重要分子标志，同时 作为EMT进程的关键分子，是研究调控肿瘤细胞 EMT机制的重要分子靶标^{[3, 6, 7]}。研究表明E-cadherin 在卵巢癌组织中的表达下调，但是机制仍然不十分 明确。microRNA是大约由20到25个核苷酸构成、进 化上高度保守的一类非编码RNA ^{[8, 9]}。它 通 过 碱 基 互 补配对的方式与靶基因的3’UTR区结合，在转录后 水平调控靶基因的表达^[10]，对于多种肿瘤细胞的生 长、分化、侵袭和转移有着重要的调控作用 ^{[11, 12]}。

为了探索miRNA与卵巢癌E-cadherin表达异常 之间的关系，本课题组首先用生物信息学分析了可 能与E-cadherin表达调控有关的miRNA，发现miR-9 是唯一能与E-cadherin编码基因（CDH1）3’UTR 区发生结合的miRNA。由此，本研究对miR-9对 E-cadherin表达的调控作用及其对卵巢癌细胞侵袭 和转移能力的影响进行了探讨。 1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器

RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司；miR-9 mimics及所用引物购自中国广州锐博生物科技有 限公司。Dual-luciferase检测试剂盒购自Promega公 司；E-cadherin，Vimentin，β-Catenin抗体购自美 国Epitomics公司；Transwell培养板由美国Corning 公司生产；Matrigel 购自美国BD公司。 1.2 生物信息学miRNA靶基因预测

使用目前公认的miRNA靶基因预测数据库 TargetScan、（http://www.targetscan.org/）、PicTar （http://pictar.mdc-berlin.de/），预测哪些miRNA 可以靶向E-cadherin的编码基因CDH1，并使用 RNA22软件计算两者的结合自由能。 1.3 细胞培养及转染

卵巢癌细胞株SKOV-3购自美国标准生物 品收藏中心（ATCC）。用含有10%胎牛血清的 DMEM培养液，5% CO2条件下传代培养。转染 前取每孔4×10⁵个细胞接种六孔板，培养过夜后， 使用Invitrogen LipofectamineTM 2000转染miR-9 mimics(100 μM) 试剂，转染miR-9 mimics 48 h后进 行后续实验。 1.4 双荧光素酶报告基因体系

构建含有CDH1 mRNA的3’UTR的双荧光素 酶报告基因体系，称为psi-check2-CDH1。miR-9 mimics 分别和psi-check2-CDH1及对照psi-check2共 转染，24 h后使用Dual-luciferase检测试剂盒检测 luciferase活性。 1.5 Western blot检测E-cadherin表达

取转染miR-9 mimics后48 h的SKOV-3细胞，裂 解细胞提取总蛋白。一抗（1:1 000稀释）4℃孵育 过夜，β-actin作为内参照，结果用Image J软件分 析条带灰度值。 1.6 细胞免疫荧光

取转染miR-9 mimics 24 h及对照组的SKOV-3细 胞，消化接种至无菌载玻片上，培养24 h，4%多聚甲 醛固定10 min，PBS冲洗，Triton100破膜5 min，PBS 冲洗，羊血清封闭室温30 min，分别加入E-cadherin （1:50稀释）、Vimentin（1:100稀释）、β-Catenin （1:100稀释）抗体，4℃孵育过夜，PBS冲洗， 加入绿色荧光二抗（1:200稀释）37℃避光孵育30 min，之后均避光操作，PBS冲洗，DIPI工作液染 核5 min，荧光显微镜下观察并拍照。 1.7 Transwell试验（细胞侵袭试验）

Matrigel用DMEM培养液1:5稀释，每孔80 ul加 入Transwell上室，37℃放置1 h备用。24孔板每孔 加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，放 入Transwell上室，每小室内加入200 μl无血清培养 液，内含含5×10³个细胞。培养24 h后取出上室， 用4%多聚甲醛固定10 min，1 g/L的结晶紫染色10 min，PBS冲洗3次，风干后置于显微镜下观察， 随机计数6个高倍镜视野计数细胞数，拍照并用 ImageJ软件分析。 1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件处理数据，计量资料 用t检验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 miR-9可与CDH1 mRNA的3’UTR区域结合

通过目前公认的miRNA靶基因预测数据库 TargetScan和PicTar预测可以靶向E-cadherin编码基 因CDH1的miRNAs。结果发现只有miR-9可以结合 于CDH1 mRNA 3’UTR区的第1327-1333号碱基， 见图 1A。RNA22软件计算结合自由能为-26.40 Kcal/mol，并且生物信息学分析显示和miR-9种子 序列特异性结合的CDH1 3’UTR序列存在高度种属 保守性，见图 1B。

图 1

Figure 1

图 1 CDH1 mRNA的3’UTR区与miR-9相结合 Figure 1 miR-9 directly targets CDH1 by interacting with its 3’UTR A: the binding site of CDH1 mRNA 3’UTR predicted by TargetScan and PicTar algorithms analysis; B:the predicted binding site of CDH1 mRNA 3’UTR with miR-9 was highly conserved in many species, and the complementary sequences of seed sequence of miR-222 were highlighted

构建含有CDH1 mRNA 3’UTR的双荧光素酶报 告载体，称为psi-check2-CDH1。miR-9 mimics 分 别和psi-check2-CDH1及对照psi-check2共转染，发 现miR-9可以降低psi-check2-CDH1组海肾荧光素 酶活性到58%（t=7.937,P=0.001）,见图2A，提示 miR-9可以与CDH1的3’UTR区相结合。

在SKOV-3中，转染miR-9 mimics 48 h，Realtime PCR检测发现miR-9表达上调为对照组的23.4 倍（t=8.257,P=0.001）；CDH1 mRNA表达降低 至对照组的24%（t=16.8，P=0.000），见图2B； Wester n blot法检测E-cadherin的表达明显下降，为 对照组的26%（t=28.3，P=0.000），见图2C。

图2

Figure 2

图2 体外验证CDH1为miR-9的靶基因 Figure 2 Validation that miR-9 directly targets CDH-1 in vitro A:Luciferase activities were measured in SKOV3 cells cotransfected with psi-check2-CDH1 with miR-9 mimic or miR-control; B: Real-time PCR of miR-9 and CDH1 mRNA in miR-9 mimic or miR control transfected cells; C: Immunoblotting of E-cadherin in miR-9 mimic or miR-control transfected cells. Values represented ±s,n=3;*:P＜0.05

转染miR-9 mimics 48 h后，显微镜见SKOV-3-miR-9细胞间连接更为松散，胞质向外延展成“伪 足”样，表现为成纤维细胞或间质细胞形态，见图 3A。免疫荧光结果显示，与对照组相比，SKOV-3-miR-9组上皮性标志物E-cadherin在胞质内表达明 显下降，而间质性标志物Vimentin和β-Catenin的荧 光强度显著增强，见图3B。

图3

Figure 3

图3 上调miR-9促进卵巢癌细胞系SKOV-3的EMT进程 Figure 3 miR-9 upregulation promotes EMT transformation of SKOV-3 cell A:phase contrast images illustrated that miR-9 mimic transfected SKOV-3 cells showed EMT morphological changes;B: Immunofluorescence staining of E-cadherin,Vimentin,β-Catenin (green) in miR-9 mimic or miR control transfected cells

划痕实验发现SKOV-3-miR-9划痕愈合程度明 显快于SKOV-3，使用TScratch软件分析划痕面细 胞覆盖面积，48 h细胞覆盖面积为93%，对照组为 61%，两者差异有统计学意义(t=3.215，P=0.032)， 见图4A。Transwell试验显示，SKOV-3-miR-9细 胞在24 h后穿过上室的细胞均数为120.33个/孔， 对照组为6个/孔，差异有统计学意义（t=13.527， P=0.000），见图4B。

图4

Figure 4

图4 上调miR-9促进卵巢癌细胞的运动和侵袭能力 Figure 4 miR-9 upregulation promotes migration and invasion of SKOV-3 cell A: wound healing test of miR-9 mimic or miR control transfected SKOV-3 cells;B: transwell invasion assay of miR-9 mimic or miR control transfected SKOV-3 cells; *: P＜0.05

在包括卵巢癌在内的很多肿瘤组织，尤其是 在转移灶中，都发现E-cadherin的异常表达，提示 E-cadherin的表达情况与肿瘤转移及远期预后密切 相关^{[13, 14, 15]}。作为EMT的关键分子，E-cadherin异常 表达可能受多种机制调控，如启动子甲基化、基 因突变等，还有研究表明miR-200家族等miRNA也 参与了EMT过程中E-cadherin的调控^{[16, 17]}。因此针 对靶向E-cadherin的miRNA的深入探索，对于揭示 肿瘤转移的分子机制和研究抗肿瘤转移药物靶点 有重要意义。本文证明了miR-9可以通过负向调控 E-cadherin表达，诱导卵巢癌细胞的EMT进程，进 而促进卵巢癌细胞的运动和侵袭能力，并可以进 一步推测，miR-9的表达高低对卵巢癌的转移和预 后具有重要影响。这为卵巢癌EMT过程的信号通 路和分子机制的研究提供了依据，为如何抑制癌 细胞转移的卵巢癌靶向治疗提供了新的思路。

miR-9在多种肿瘤中被证实为肿瘤相关miRNA， 可以影响不同的肿瘤细胞的生长、转移或耐药 等。Iorio等^[18]研究发现，与癌旁的正常乳腺组织 相比，乳腺癌组织中存在miR-9的高表达；在人 神经胶质瘤中，也报道高表达的miR-9通过调控 Chromobox 7（CBX7）参与胶质瘤的发生发展 ^[19]。 然而对miR-9的表达水平与肿瘤的关系，研究者 们也有不一致的看法。Laios等^[20]发现，miR-9的 低表达能通过通过调控bcl-2，CLDN等诱导卵巢 癌的化疗耐药。由于miRNA和其靶基因作用关系 网络复杂，一个miRNA可以调控多个靶基因，一 个靶基因可以被多个miRNA调控，形成复杂的反 馈调节关系，因此推测miR-9不仅可以通过调控 E-cadherin进而诱导卵巢癌细胞EMT进程，促进侵 袭转移能力，还有可能通过其他的作用靶点来影 响卵巢癌细胞的生长、耐药等其他恶性生物学行 为。如何更全面地阐明肿瘤相关miRNA在卵巢癌 发生发展中的作用，仍需进一步探索。