关于恶性胸膜肿瘤导致胸水的原因，常认为 与肿瘤组织的水液通透性增加有关，具体机制尚 未完全明了。水通道蛋白是一组与水通透性有关 的细胞膜转运蛋白，水通道蛋白1 （aquaporin-1， AQP1）是参与肺部水液转运功能蛋白中最为重 要的一种，广泛表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞、支气 管黏膜下腺及气管腔上皮细胞顶膜面^{[1, 2]}。它在肺 部的多项生理功能中起着重要的作用，与肿瘤的 发生、发展有密切的关系^{[3, 4]}，在肺癌组织内， AQP1 的表达明显增强,应用AQP1抑制剂可以抑 制肺癌的侵袭和转移^{[5, 6]}。一些学者发现，水通道 蛋白参与了肿瘤组织的构建^[3]，水通道蛋白可以促 进肿瘤的增殖^{[7, 8]}。而检测某种水通道蛋白的水平 可以协助鉴别或诊断一些肿瘤性的疾病^[4]。已有研 究发现，AQP1与肺癌细胞对组织的侵袭有关^[9]， 同时，它与肺腺癌和肺部间皮瘤的发生也有一定 关系^[10]，一些研究发现：水通道蛋白与非小细胞 肺癌关系密切^{[10, 11, 12, 13]}，此外，它还参与了肺部肿瘤 细胞的迁移，对周围组织造成了影响^[14]，肺腺癌 的发生、发展也与水通道蛋白的关系极为密切。 因此，水通道蛋白与呼吸系统肿瘤有着密切的关系。然而，关于AQP1与胸膜肿瘤关系的研究却鲜 见报道。为揭示在胸膜恶性肿瘤的进展中AQP1的 作用及两者间的关系，我们进行了这一研究，希 x望能为胸膜恶性肿瘤的治疗提供新思路。

采用C57BL/6J品系小鼠，由广州医学院动物 实验中心提供，鼠龄6～8周，体重约25 g，雌雄不 限。分三组(T6，T8，T10)，每组7只，各组设立 正常对照，分别于注射肿瘤细胞6、8、10天后处 死小鼠，肿瘤细胞来源于广州市第一人民医院中 心实验室。

培养Lewi's肺癌细胞，之后加入PBS配制细胞 悬液（浓度调至1×106/ml），乙醚麻醉小鼠后仰卧 位固定，消毒后，采用1 ml注射器和5号针头，吸 取细胞悬液0.05 ml，于小鼠右侧腋前线剑突水平 进针，针头斜向上与胸壁约成30°角，有落空感后 停针注射。对照组小鼠在右侧胸腔接受注入等量 的0.9%氯化钠溶液。

低温离心机，核酸-微量蛋白测定仪，电泳 仪，ABI 7500全自动荧光定量PCR仪，A高通量 DNA合成仪，彩色病理图像免疫组织化学测量系 统，CO2培养箱，胎牛血清，DMEM培养液粉剂， DAB试剂盒（DAKO公司），兔抗鼠AQP1 多克隆 抗体（Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶标记的 抗兔Envision多聚物（Santa cruz公司）。

取胸水：过量麻醉处死小鼠，仰卧位固定 好，沿胸骨中线小心剪开胸壁，避免破坏膈肌， 暴露胸膜腔，记录肿瘤生长情况及胸水性状，以 1 ml注射器收集胸腔内液体并记量。取胸膜组织： 剪下小鼠胸壁，固定于板上，以手术尖刀小心切 割壁层胸膜，分别放于-80℃冰箱及多聚甲醛液体 中保存。

胸 膜标本经固定、脱水、透明、浸蜡后，进行包 埋、切片，脱蜡至水。经水浴、TBS洗、抗原修 后，顺序加入一抗、二抗，经DAB显色、苏木精 染色后，用二甲苯透明、风干。用中性树胶封片 保存。胸膜上皮细胞内的AQP1阳性显色后，呈现 为亮棕色，颜色深浅与其水平呈正相关，以PBS 代替一抗作为阴性对照，之后采用HPISA210000 彩色病理图像免疫组织化学测量系统进行图像分 析，测量AQP1表达的平均灰度值。

在EP管中加入Trizol酶1 ml，加50～100 mg胸膜组织，将组织彻底匀浆溶解，经水浴、氯 仿混匀、冷冻离心后，取液相，加0.5 ml异丙醇， 混匀后静置10 min，冷冻离心后弃上清液，加乙醇 混匀后4℃离心,弃上清液，干燥后加DEPC水浴。 取RNA样品，用紫外分光光度仪分别于A260、 A280处比色，求A260/A280比值。RNA浓度=A260 值×40 μg/ml ×250。采用Invitrogen反转录试剂盒， 以Oligo(dT)18为引物，按照试剂盒要求进行反转 录，之后保存于-20℃备用。根据NCBI Genebank 中的小鼠AQP1基因序列进行引物设计，采用 Primer express 2.0 软件，设计序列如下

M-AQP1（92 bp）

Forward Primer: 5’-CTA CAC TGG CTG CGG TAT CAA C-3’

Reverse Primer: 5’-GCC CCA CCC AGA AAA TCC-3’

内参序列：M-GAPDH（73 bp）

Forward Primer: 5’-CGT GTT CCT ACC CCC AAT GT-3’

Reverse Primer: 5’-TGT CAT CAT ACT TGG CAG GTT TCT-3’

委托达安基因公司合成引物，实时荧光定量 PCR 反应体系在ABI 3900 Real-time PCR 仪上进 行，PCR扩增共40循环，在每个循环的第二个步 骤收集荧光信号，采用比较2-ΔΔCt法。结果按拷贝 数分析，用B表示，即B=拷贝数/μl cDNA。考虑 到各个样本总RNA浓度的差异，最终计算结果按 下列公式换算：A = B（目的基因）/B（内参基 因），A值是统计时最终需要的数值。

全部数据采用SPSS11.0医用统计软件进行分 析，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检 验（student’s t-test）。P<0.05为差异有统计学意义。

各对照组小鼠无死亡，解剖胸腔发现内壁光 滑，未发现胸腔积液；胸膜恶性肿瘤组21只鼠无 死亡，均可见血性胸腔积液，位于右侧胸膜腔， 其中17只可见白色肿瘤结节，见图 1A。壁层胸膜石蜡切片的HE染色可见肿瘤细胞侵袭壁层胸膜， 癌细胞排列紧密，间质结缔组织少，新生毛细血 管丰富，见图 1B。解剖胸腔可见右侧胸膜腔存在 血性胸腔积液，随着肿瘤在胸膜腔内种植时间的 延长，胸水量从6天时的（0.37±0.03）ml增加到10 天时的（0.66±0.06）ml （P=0.04），见表1。

图 1

Figure 1

图 1 Lewi's lung cancer cell（LLC）注入C57BL/6J小鼠 胸膜腔后8天肉眼观（A）及镜下组织学形态（B） Figure 1Histological changes of pleural cavity by naked eyes(A) and of partial pleural under microscope(B) after LLC cell was injected for 8 days A:the Lewi's lung cancer cells suspension(1×106/L) was injected into C57BL/6J mice’s right pleural cavity for 8 days,bloody pleural fl uid was observed and there was round white visible tumor growth on partial pleura; B: We could observe the growth and infi ltration of tumor cell in partial pleura(HE staining 20×10)

表1(Table 1)

表1 各组小鼠的胸水量(x±s) Table 1 Amount of pleural effusion of each group (x±s)

表1 5-Fu血药浓度与化疗不良反应的相关情况 Table 1 Correlation between 5-Fu concentration and adverse events

AQP1表达于胸膜壁层间皮细胞，经免疫组 织化学染色并测定平均灰度值，胸膜恶性肿瘤组 小鼠壁层胸膜AQP1表达较对照组明显增强，见 图 2。对照组小鼠的AQP1平均灰度在6、8、10 天分别为（0.20±0.03）、（0.17±0.04）、（0.20 ±0.04），组间差异无统计学意义(P>0.08）。胸 膜恶性肿瘤组小鼠AQP1平均灰度在6、8、10天 分别为（0.42±0.03）、（0.58±0.05）、（0.65± 0.05），各组差异有统计学意义(P=0.03）。胸膜 恶性肿瘤组小鼠AQP1水平较相应天数的对照组小 鼠高，差别有统计学意义(P<0.02），见图 2、3。

图 2

Figure 2

图 2 壁层胸膜水通道蛋白1的表达 Figure 2The level of AQP1 of partial plural *:compared with T6 group(the Tumor group which was injected LLC cells for 6 days),P<0.05; #:compared with T8 group(the Tumor group which was injected LLC cells for 8 days),P<0.001;a:compared with control group,P<0.01

图 3

Figure 3

图 3 壁层胸膜的免疫组织化学染色结果( ×40) Figure 3Immunohistochemistry staining of partial pleura (×40) A:control group; B:T10 group

AQP1基因与管家基因的PCR标准曲线斜率 接近，经检验其相关系数r=0.970，两种基因扩 增效率一致。对照组小鼠AQP1-mRNA的相对 值在6、8、10天分别为（1.05±0.12）、（1.19±0.12）、（1.02±0.18），组间差异无统计学 意义(P=0.06）。胸膜恶性肿瘤组小鼠AQP1- mRNA的相对值在6、8、10天分别为3.04±0.27、 3.87±0.28、4.95±0.54，各组差异有统计学意义 (P=0.01）。胸膜恶性肿瘤组小鼠AQP1-mRNA的 相对值较相应天数的对照组小鼠高，差别有统计 学意义(P=0.04），见图 4。

图 4

Figure 4

图 4 壁层胸膜AQP1-mRNA表达 Figure 4 The level of AQP1-mRNA of partial plural *:P<0.05,vs. T6 group; #:P<0.001,vs. T8 group; a:P<0.01,vs. control group

经直线相关分析，T6、T8、T10组胸水量 与AQP1的表达存在正相关关系(r=0.97,r=0.92, r=0.98)，与AQP1mRNA的表达也存在正相关关系 (r=0.93,r=0.96,r=0.94)。

呼吸系统恶性肿瘤在临床上极为常见，随着 我国人口老龄化加剧、生活环境的污染，以及吸 烟人口的增加，呼吸系统肿瘤的发病率急剧增 多，发病率上升极快。然而，在呼吸系统肿瘤 中，胸膜恶性肿瘤相对少见，但其发展迅速，出 现恶性胸腔积液较早，常常造成严重的呼吸困难 和循环障碍，危及生命。因而，积极研究其发生 机制是进一步治疗胸膜恶性肿瘤的前提和基础。 然而，由于胸膜恶性肿瘤的病因、发病机制及病 理变化十分复杂，有多种因素的参与，相关研究 相对较少，尤其是关于发生机制这一方面。

AQP1是第一个被发现的水通道蛋白，广泛 分布于肺部，在其水液转运中起着极其重要的作 用，它与肿瘤的发生有一定的关系。众所周知， 在肿瘤的发生发展过程中，癌细胞增殖、分裂的 速度较正常组织细胞大大加快。同时，为了满足 肿瘤侵袭转移的需要，癌细胞某些酶的活性和表 达也发生了改变，进而使细胞蛋白质、核酸的合 成加强，而所有这些生命活动都离不开水的微环 境和参与。因而，癌细胞比正常细胞更需要水分 子的快速跨膜转运。这是水通道蛋白参与胸膜恶 性肿瘤构建的理论基础。

一些学者已在此方面进行了一定的研究，并 有所发现。在乳腺癌和恶性胶质瘤中，水通道蛋 白1的表达都发生了改变，据此，有人设想可将 其用于肿瘤的协助诊断^[4]。水通道蛋白1参与了肺 癌的进展和侵袭，促进了肿瘤的增殖^{[7, 8, 14]} ，而运 用AQPs的抑制剂则可以部分抑制肺癌的侵袭和转 移。水通道蛋白在肿瘤中的作用，已越来越受到 大家的关注。然而，关于胸膜恶性肿瘤与水通道 蛋白关系的研究，却未见报道。

鉴于临床胸膜恶性肿瘤患者标本收集难度较 大，时间较长，我们先进行了动物研究，建立了 胸膜恶性肿瘤的动物模型，在不同时间点检测壁 层胸膜AQP1在蛋白和mRNA水平的表达，发现随 着胸膜恶性肿瘤的进展，肿瘤小鼠的恶性胸腔积 液量增加，同时，壁层胸膜AQP1及其mRNA的表 达明显增加，胸水量与AQP1水平亦呈正相关关 系。根据实验结果，我们认为AQP1参与了胸膜恶性肿瘤的进展。这与既往的研究结果并不矛盾， 并从分子生物学层面，部分揭示了胸膜恶性肿瘤 发生、发展的机制，希望能为进一步研究、治疗 胸膜恶性肿瘤提供一定的帮助。同时也提示我 们：在临床对胸膜恶性肿瘤的治疗中，发掘相应 的AQP1阻断剂、抑制剂来影响其生物学效应，有 可能是治疗胸膜恶性肿瘤的一个新途径。