肿瘤和间质之间的相互作用是肿瘤发生侵袭 和转移的重要条件。肿瘤可分泌多种因子诱导间 质细胞活化，而活化的间质细胞又通过分泌细胞 因子和基质蛋白酶等促进肿瘤的增殖、浸润与转 移^[1]。此外，相对于肿瘤细胞容易突变产生抗肿瘤 药物的耐药性，间质细胞还具有基因型相对稳定 的特质，因此选择这群细胞表面抗原为靶标，进 而切断间质对肿瘤细胞的支持促进作用，不失为 一种富有前景的肿瘤免疫治疗策略。

成纤维细胞激活蛋白α（fibroblast activation protein α，FAPα）是高表达于肿瘤间质成纤维细 胞表面的特异性标志物。FAPα是一种丝氨酸蛋白 酶，具有胶原酶和二肽酶的活性，通过参与肿瘤-宿主界面基质的降解和重建，对肿瘤的生长、浸 润和转移具有重要意义^{[2, 3]}。近年来，FAPα作为一 种极具潜力的抗肿瘤靶标分子正备受关注。这是 因为：(1) FAPα在90%以上的上皮性肿瘤间质细胞 中恒定表达，正常组织仅限于胚胎及愈合创口； (2) FAPα阳性的间质细胞构成了50%~ 95%肿瘤基 质成分，靶位十分丰富；(3) FAPα阳性间质细胞主 要分布于肿瘤血管周围，这为以FAPα为靶标的肿 瘤免疫治疗能够有效阻断肿瘤组织血液供应提供了有利条件^{[4, 5]}。在前期实验中，通过分子克隆的 方法我们制备了来源于FAPα的多肽FAPτ。本研 究重点探讨FAP?τ的抗肿瘤活性。 1 材料与方法 1.1 实验动物和试剂

SPF级4~6周龄BalB/c雌鼠，购自中山大学实验 动物中心，动物生产许可证[SCSK(粤)2004-0011]。 RPMI 1640，FCS购自美国Gibco公司；PECD8单抗、抗小鼠IFN-γ抗体、FITC-IgG二抗、 细胞固定穿孔试剂均购自美国Beckman Coulter 公司；HRP-二抗购自博士德；氟氏不完全佐剂 (FICA)、IL-2、BSA 购自美国Sigma公司；其余主 要化学试剂均为国产分析纯试剂。 1.2 SDS-PAGE 检测FAPτ纯度

取FAPτ结晶10 μg，3% SDS溶解，12% SDSPAGE分离，经考马斯亮蓝染色后观察其条带。 1.3 小鼠免疫及肿瘤测量

小鼠免疫及肿瘤测量方法见参考文献^[6]。 1.3.1 疫苗制备

将FAPτ在PBS中充分研磨，加 入同体积FICA乳化均匀，每只小鼠0.2 ml。PBS对 照组则没有FAPτ，制备方法同上。 1.3.2 实验分组及动物免疫

BalB/c小鼠20只，随 机分为2组，每组10只，分别为：PBS对照组，FAPτ 免疫组。首次免疫FAPτ 每只300 μg，加强免疫使 用半量。各组动物分别于第1、14、21天时进行背部 皮下多点免疫，见图1。第2、3次均为加强免疫。

图1

Figure 1

图1 小鼠肿瘤接种及免疫时限表Figure 1TTumor implantation and immune time table

小鼠第二次免疫3天后，于 左侧第四对乳腺脂肪垫处，以10⁵/100 μl的体积接种 4T1肿瘤细胞。当肿瘤长径达到3 mm以上时测其长径 a和短径b，按v=1/2ab 2算出肿瘤体积，绘制肿瘤体积 变化曲线并记录小鼠死亡情况。当小鼠肿瘤体积超过 3 000 mm 3时将小鼠颈椎脱臼法处死，结束实验。 1.4 小鼠血清中FAPτ抗体滴度检测 1.4.1 小鼠血清制备

肿瘤接种后22天，各组小鼠经尾 静脉取血200 μl左右离心，取上层血清，4℃放置备用。 1.4.2 间接ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度

以 每孔50 ng FAPτ包被ELISA板，4℃过夜；2％ BSA 4℃封闭过夜；被检血清以1∶1000依次倍比 稀释，37℃孵育1 h；HRP标记二抗1∶8 000稀释，室温孵育1 h；每孔0.2 ml TMB溶液室温避光作用 30 min；2 M H2SO4终止反应；酶标仪450 nm处测 定显色反应结果。 1.5 小鼠脾脏淋巴细胞制备及流式细胞仪检测

肿瘤接种后22天，取小鼠脾脏，制成单细胞 悬液，NH4Cl裂解去除红细胞，用含10%FBS的 RPMI1640培养液重悬，CO2 孵箱内培养。FAPτ5 μg/ml体外再次刺激，同时加入IL-2 300 u/ml，72 h 后，收集细胞，并分别孵育以下抗体，PE-CD8单 抗，抗小鼠IFN-γ 抗体，FITC-IgG二抗，行流式细胞 仪检测。 1.6 统计学方法

用统计软件SPSS 13.0对结果进行双尾t检验分 析，P< 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 FAPτ纯度检测

FAPτ行SDS-PAGE分离并经考马斯亮蓝染色后显 示，其纯度达90% 以上，足可用于下一步实验，见图2。

图2

Figure 2

图2 FAPτ经SDS-PAGE分离结果示意图Figure 2FAPτ polypeptide detected by SDS-PAGE

在肿瘤接种后30天内，FAPτ疫苗免疫组小鼠肿瘤 生长速度显著低于PBS对照组，其差异具有统计学意 义(P= 0.027)，见图3。小鼠存活率记录曲线显示，FAPτ 疫苗免疫组小鼠存活率较PBS对照组高，见图4。

图3

Figure 3

图3两组小鼠的肿瘤体积变化图Figure 3Changes of tumor volume of two groups

图4

Figure 4

图4荷瘤小鼠存活率示意图Figure 4Survival rate of tumor-bearing mice treated during experiment

结果显示，与PBS对照组相比，FAPτ免疫组 血清检测到较高滴度的抗体产生，见图5。

图5

Figure 5

图5ELISA检测小鼠血清中FAPτ特异性抗体滴度Figure 5FAPτspecific antibody titer in murine serum detected by ELISA

结果显示，在FAPτ免疫组小鼠脾脏内检测到 约5.73%的CD8⁺T细胞表达IFN-γ，而PBS 对照组 约1.33%的CD8⁺T 细胞表达IFN-γ，见图6。

图6

Figure 6

图6流式细胞仪检测小鼠脾脏CD8+T细胞内IFN- γ表达水平Figure 6IFN-γ expression in splenic CD8+T cells detected by flow cytometer

目前以FAPα为基础的肿瘤疫苗大多是选取 FAPα全部氨基酸序列或其膜外蛋白区域的氨基酸 序列，其抗原体积较大，抗原表位过多容易引发 机体的非特异性免疫应答。与大分子蛋白相比，小分子多肽具有诱发高度特异性免疫反应，毒性 小和成本低，制备简易，便于商业化等优势^[7]。因此，我们选取了FAPα ?内富含T细胞表位的多肽 FAPτ，研究其抗肿瘤效应。

Lee等^[8]证实FAP?α表达于小鼠乳腺癌肿瘤间 质，在细胞株内不表达。本实验室也证实了同样 的结果，因此，选择4Τ1乳腺癌作为肿瘤模型。 实验证实，在小鼠肿瘤接种后6~30天FAPτ 疫苗 能够显著降低小鼠肿瘤生长速度，显示出较强的 抗肿瘤作用；然而，肿瘤接种30天后，FAPτ 疫 苗免疫组小鼠肿瘤生长速度与对照组差异逐渐变 小（图3），究其原因如下：从30天到实验记录 结束，由于小鼠的死亡逐渐增加，致使样本数减 少，每组小鼠间肿瘤体积误差增大；其次，随着 免疫时限的延长，免疫效价逐渐降低，加之FAPα 在4T1乳腺癌内表达丰度不高及4Τ1肿瘤的高侵袭 能力，导致两组间差异变小。

Loeffler等^[9]构建了FAPαDNA口服疫苗，该疫 苗显著增加了肿瘤组织对化疗药物的摄取量，抑制 了肿瘤生长并延长了荷瘤小鼠的存活时间。该组^[10] 进一步利用4T1乳腺癌小鼠模型证实FAPαDNA疫 苗对肿瘤的生长和转移的抑制作用主要是通过调节 肿瘤免疫微环境中的极性，即促进肿瘤组织内Th2 细胞向Th1细胞的转化来实现的。然而，在肿瘤杀 伤过程中起主导作用的是CD8 ⁺T细胞。肿瘤免疫治 疗策略主要以激活CD8⁺T细胞免疫应答为中心，特 别是诱生肿瘤特异性的CTL ^[11]。本研究组制备的抗 原为不溶性颗粒抗原，在体内主要激活CD8⁺T细 胞，因此，除了体液免疫应答外，我们重点检测了 CD8⁺T细胞免疫应答，并证实FAPτ?免疫组较对照 组能够显著激活CD8⁺T细胞应答。