三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC) 是ER、PR、HER2 蛋白表达均为阴性的乳腺癌。 由于其缺乏雌激素受体表达，对内分泌治疗不敏 感，预后相对较差，多以内脏转移为特点，近年 来引起广泛关注。不过，该类型乳腺癌的生物学 异质性也很强，不同个体间的临床表现差异很 大，需要寻找对其进一步区分的方法，并从分子 水平加深对其生物学机制的认识。

上皮间叶转化(Epithelial–mesenchymal transitions， EMT)是癌症发生转移的可能机制之一，它以上皮 细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征。 E-cadherin、β-catenin及Vimentin均为EMT相关的 重要指标，本研究检测其在三阴性乳腺癌中的表 达。 1 资料与方法 1.1 一般资料

采用本研究团队的一组240例乳腺癌病例数据 库，前期系列研究^[1]已收集完整临床病理参数， 并完成ER、PR、HER2的检测，本研究取其中的51例三阴性乳腺癌原发灶石蜡包埋标本，检测 E-cadherin、β-catenin及Vimentin的表达，具体如下。

51例三阴性乳腺癌为2002年1月—2003年12 月在湖北省肿瘤医院乳腺科住院治疗患者。均为 女性，年龄29～69岁，中位年龄50岁；绝经前 34例，绝经后17例。原发灶直径≤2 cm者4例， 2.1～5 cm者36例，＞5 cm者11例；17例接受过 1～4周期的新辅助化疗。全部患者均经手术治 疗，其中根治术7例，改良根治术44例。这些患者 均经病理学确诊为乳腺癌，其中导管浸润癌非特 殊型44例、小叶浸润癌1例、导管浸润癌特殊型6 例；病理分级Ⅰ级3例，Ⅱ级23例，Ⅲ级25例。腋 窝淋巴结阳性25例，阴性26例。术后均给予辅助 化疗,其中46例为含蒽环类和（或）紫杉类化疗药 物方案。淋巴结阳性患者给予放疗。 1.2 随访

将手术治疗作为随访起始时间,以5年内发现 局部或远处复发为终止事件,随访截止日期为2009 年12 月30 日。共24例出现局部复发或远处转移， 其中肺转移4例，肝转移1例，骨转移4例，脑转移 2例，其他部位复发13例。 1.3 免疫组织化学染色

E-cadherin、β-catenin和Vimentin单克隆抗体均 购自北京中杉金桥生物技术公司。实验步骤：取 51例乳腺癌原发灶石蜡包埋标本，切片厚4 μm， 微波煮沸抗原修复，置于PBS中；滴加3%过氧化 氢阻断内源性过氧化物酶，孵育10 min；蒸馏水漂 洗，置于PBS中10 min，加一抗室温孵育1 h；PBS 漂洗10 min，滴加EnVision 试剂孵育30 min；PBS 漂洗10 min，二氨基联苯胺光学显微镜控制下显 色；蒸馏水洗，复染、封片。 1.4 结果判定

由两位病理医生独立阅片，确定免疫组织化 学结果。两位阅片专家意见不一致时则经商讨决 定结果。

采用半定量计分法判定，以癌细胞染色百 分比及染色强度两方面分别计分，综合评判。 其中癌细胞染色<5%为0分；5%~35%为1分； >35%~70%为2分；>70%为3分；癌细胞按染色强 度分为4等：0分为无染色；1分为浅黄色；2分为 棕黄色；3分为棕褐色。综合计分：染色强度计分 ×染色百分比计分。将0～2分定为阴性，2分以上 定为阳性。 1.5 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行分析。单因素生 存分析采用Kaplan-Meier法计算，Log-rank检验。 多因素分析采用Cox回归模型计算，P<0.05为差异 有统计学意义。 2 结果 2.1 E-cadherin和β-catenin在三阴性乳腺癌中的表达及与Vimentn的联合表达情况

E-cadherin和β-catenin在三阴性乳腺癌中均以细 胞膜表达为主，伴随部分细胞质表达，未见细胞核表 达，见图1。其阳性表达例数分别为27例(52.94%)， 7例(13.73%)。正常情况下，Vimentin在间质细胞 中呈阳性反应，而癌细胞中呈阴性反应，本实验 以癌细胞中的Vimentin表达进行计分，间质细胞中 的表达不作统计。结果，我们检测到Vimentin阳性 表达有31(60.78%)例。

图1 E-cadherin、ß-catenin、Vimentin在三阴性乳腺癌中的表达（Envision法×100） Figure 1 Positive expressions of E-cadherin, ß-catenin and Vimentin in triple-negative breast cancer(Envision ×100)

如果定义E-cadherin阴性、β-catenin阴性或 Vimentin阳性为异常表达，则在本组病例中，三项 均正常、一或二项不正常以及三项均不正常的分 别有1例(1.96%)、37例(72.55%)、13例(25.49%)。 将三项表达均不正常的病例定义为EMT1组，共13 例；其余为EMT0组，共38例，见图2。

图2 E-cadherin、ß-catenin、Vimentin在EMT分组中的表达及复发情况 Figure 2 Expressions of E-cadherin, ß-catenin and Vimentin and recurrence in EMT groups

以5年无瘤生存（5-year DFS）为参数指标做比 较，单因素分析，EMT1组的复发病例数较EMT0 组明显增多，差异有极显著统计学意义（Log-rank 检验，P<0.01），其Kaplan Meier无瘤生存（DFS） 曲线见图3。进一步通过Cox模型多因素分析，比较 两组的传统预后相关指标：肿瘤大小、腋窝淋巴结 状态和组织学分级等发现，它们在两组间的差异无 统计学意义（P>0.05），见表1。

图3 单因素分析EMT分组与5年无瘤生存的关系 Figure 3 单因素分析EMT分组与5年无瘤生存的关系

表1(Table 1)

表1 Cox模型多因素分析比较EMT1及EMT0结果 Table 1 Cox regression model analysis results

表1 Cox模型多因素分析比较EMT1及EMT0结果 Table 1 Cox regression model analysis results

三阴性乳癌患者约占乳腺癌人群的10% ～16%^[2]。其总体临床病理特征是：肿瘤体积较 大，组织学分级较高，较非三阴性乳腺癌患者无 瘤生存率和总生存率均显著降低；与其他类型乳 腺癌相比，亦较早发生局部复发和远处转移^{[3, 4, 5, 6]}， 内脏转移率高于骨转移，易发生脊髓、脑膜、 脑、肝和肺转移，但其机制尚不明确。

Thompson 等^[6]将波形蛋白在上皮性肿瘤细胞 的表达,以及促进肿瘤细胞侵袭转移的现象定义为 EMT，即上皮-间叶转化。它以上皮细胞极性的丧 失及间质特性的获得为重要特征^[7]。 E-cadherin为重要的细胞黏附分子,是一类建

立细胞间紧密连接,维持细胞极性,保持组织结构 完整的钙依赖性跨膜糖蛋白. 作为抑癌基因,其 所介导的黏附系统已被公认为“浸润抑制系统”^[8], 能抑制肿瘤细胞从原发灶脱落,为重要的肿瘤转 移抑制因素之一。E-cadherin的功能不仅需要钙 离子存在,还需要与其配体-连接素(β-catenin)结 合成E-cadherin-β-catenin复合体才能发挥作用。 β-catenin在细胞膜上与E-cadherin形成复合体， 共同参与细胞之间的黏附作用。E-cadherin、 β-catenin的表达下调使得细胞间的黏附能力下降， 转移和侵袭能力增强。在多种肿瘤中（如结肠 癌、肺癌等）也发现E-cadherin/β-catenin复合体的 破坏，与肿瘤的复发转移密切相关^{[7, 9, 10, 11]}。

EMT的另一个重要标志是间叶标记的表达， 如Vimentin等，许多研究显示，波形蛋白的表达与 肿瘤的分化程度以及细胞侵袭的表现型和肿瘤患 者的生存期缩短相关^{[12, 13]}。

在本组三阴性乳腺癌中，我们发现绝大部分 病例伴随着不同程度的E-cadherin/β-catenin复合 体的破坏和（或）Vimentin的异常表达。我们认 为这可能是癌细胞在浸润转移过程中发生EMT的 结果，而这也很可能是其预后较差的重要原因。 E-cadherin、β-catenin和Vimentin都是上皮间叶转化 的重要标志物，其表达异常已在多种肿瘤中分别 被证实与预后相关^{[14, 15]}。但将它们联合检测并用于 预后判断的研究很少见。本组51例中同时检测到 三种标志物异常表达的有13例(25.49%)，其5年无 瘤生存率明显低于其他病例。我们分析认为，这 些标志物同时异常表达或部分异常表达可能代表着EMT发生的不同水平状态。由于病例数较少， 我们不能分析其中两种或一种标志物异常时的预 后与它们之间的差异。也可能正是这个原因，在 多因素分析中，我们没有看到统计学上的差异。

不过，EMT受庞大的细胞信号网络的调节， 其作用机制十分复杂，EMT的发生可以是瞬时 的，并且可以被微环境的调节所逆转^[8]，其在肿瘤 转移中所起的作用也存在一定争议，Lou 等^[16]研 究发现,大量原发乳腺癌细胞67NR表达Vimentin, 不表达E-cadherin,但是不发生转移; 4T1细胞表达 E-cadherin但可以转移;66cl4 细胞表达混合型表型 且发生肺转移。这一结果提示,乳腺癌细胞的转移 能力并不与EMT严格相关。

稳态的肿瘤细胞要进入细胞间质完成浸润必 需挣脱细胞之间的黏附,突破基底膜屏障。EMT为 这个破环过程的潜在机制提供了一个新的视野。 已知EMT 相关的上调和下调蛋白与肿瘤的发展相 关。三阴性乳腺癌其实是一个异质性很强的乳腺 癌群体，其中也包括了一部分预后良好的患者， 只是目前还缺乏有效的分类方法。EMT相关蛋白 在三阴性乳腺癌中的表达异常可能从一个方面预 示着其容易发生转移的机制，其适当应用可能对 区分该类型乳腺癌的异质性有一定价值。当然， 本研究病例数有限，所得结论有待进一步验证。