近年来，基于肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 方法^[1]和血清学筛选的SEREX方法^{[2, 3, 4]}的建立和应 用，目前己发现了许多具有开发免疫治疗前景的 肿瘤相关抗原，其中癌-睾丸(cancer-testis，CT) 抗原被认为是最具有开发前景的抗原，这是因为 CT抗原家族成员具有一个共同特性,即在广泛肿 瘤组织中有不同频率的表达，而在正常组织除睾 丸及卵巢的生殖细胞（卵母细胞）外，均呈低或 者不表达^[5]。由于睾丸等生殖细胞处于免疫豁免 区，它不表达主要组织相容性复合体-Ⅰ（major histocompayibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ）类分子， 虽有基因的转录但并不导致抗原的表达，故认为 CT抗原是一类广谱的肿瘤特异性抗原，也是最有 吸引力、最具开发前景的肿瘤抗原家族之一^[6]。 近年来国外已将其中一些CT抗原应用于临床，如用黑色素瘤抗原编码基因（melanoma antigenencoding gene,MAGE）的抗原肽对黑色素瘤进行 免疫治疗，已收到了可喜的疗效^[7]。GAGE作为CT 抗原的一种，于1995年首次被鉴定^[2]，目前己陆续 发现它在多种肿瘤中有着不同频率的表达。前期 研究表明GAGE基因在肝细胞癌中有较高频率的表 达^[8]。为探讨GAGE蛋白在肝癌临床免疫治疗中应 用的可行性，本实验从QGY-7701肝癌细胞株扩增 GAGE-1片段，将该片段编码的蛋白进行原核表达 和分离纯化，制备较高纯度的GAGE-1融合蛋白， 为深入研究GAGE蛋白在肝癌免疫治疗中的应用提 供基本的实验依据。 1 材料和方法 1. 1 主要试剂及标本

Trizol购自Gibco BRL公司，Superscript^TM反 转录试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4 连接酶为MBI公司产品，Taq DNA聚合酶购自 Promega公司，原核表达载体PGEX-6P-1及宿主菌 TB1为NEB产品；人肝癌QGY-7701细胞株购于中 国医学科学院上海细胞所；pGEM-T vector system 为Promega 公司产品；GST柱试剂为NEB( New England Biolabs) 产品；PCR 产物纯化试剂盒为天 为时代科技公司产品；DH5ɑ、BL21(DE3)细菌由 上海生工提供。其他常规试剂均为进口分装或国 产分析纯。 1.2 RT-PCR和PCR产物的克隆和测序

用Trizol抽提人肝癌细胞株QGY-7701中 GAGE-1表达阳性标本的总RNA，按Superscript^TM 反转录试剂盒说明书的操作步骤，合成cDNA的 第一链，PCR扩增GAGE-1 5’端片段。GAGE-1基 因扩增正义序列：5′- AGA CGC TAC GTA GAG CCT- 3′，反义序列：5′-CCA TCA GGA CCA TCT TCA -3′，分别带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位 点。PCR反应条件：94℃预变性5 min后，开始以 下循环:94℃1 min→52℃1 min →72℃2 min，共 30个循环，反应终末于72℃延长8 min，4℃停止反 应。反应完毕取10 μl PCR产物行1.5%非变性琼脂 糖凝胶电泳分析，1.5%琼脂糖分离PCR扩增的特 异性片段，按试剂盒说明书纯化产物，将目的基 因亚克隆至T载体Pmd 18中，经氨卞青霉素Amp抗 性筛选阳性克隆，双酶切及PCR证实是否有相应 大小的外源片段插入，最后经上海生物工程有限 公司测序进一步证实。 1.3 pGEX-T-GAGE-1重组表达载体的构建和序列测定

EcoRⅠ和NotⅠ双酶切重组T载体和原核表达 载体pGEX-T（+），T4 DNA连接酶16℃过夜连 接，将GAGE-1片段定向克隆到pGEX-T（+）上， 连接产物转化感受态BL21（DE3）菌，Amp平板 筛选阳性克隆，经双酶切、PCR和测序鉴定，将 构建的重组质粒取名pGEX-6P-1-GAGE-1。 1.4 GAGE-1融合蛋白的诱导表达

挑取单个经重组质粒转化的菌落接种LB 培养液（含Amp150 mg/L），30℃剧烈振荡 培养至A600=0.5，加入终浓度为0.2 mMol/L 的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside,IPTG），30℃诱导3 h,离心收集诱 导前后菌体沉淀，SDS-PAGE电泳分析。 1.5 GAGE-1融合蛋白的大量表达及纯化

在预期相对分子量位置有高表达蛋白质条 带出现以后，用上述方法大量诱导目的蛋白的 表达。菌体用PBS重悬，超声裂解，低温离心。 上清用0.5 μm滤膜过滤后经GST纯化，先用A液 （20 mM Tris+150 mM NaCl pH8.0）充分平衡GST 柱，将离心后得到的上清过GST柱，上样后再用 A液淋洗至平衡，然后进行B液（20 mM Tris+150 mM NaCl+10 mM GSH pH8.0）洗脱，将得到的 洗脱液进一步经过superdexG75精制液（无热原1 ×PBS）洗脱，将预期相对分子量位置的洗脱液进 行SDS-PAGE电泳，凝胶薄层扫描分析蛋白纯度， Bradford方法定量分析蛋白浓度，-70℃保存。 2 结果 2.1 GAGE-1cDNA的获取及序列测定

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示大小约 251 bp的特异性单一条带，经测序分析完全正确， 与GenBank数据库(gi:914898 )对比，序列完全一 致，见图1。 2.2 pGEX-6P-1-GAGE-1表达载体的鉴定

图1 GAGE-1基因RT-PCR扩增产物电泳图 Figure 1 The electropherogram of GAGE-1 gene by RT-PCR

用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将目的 基因从重组T载体克隆至原核表达载体pGEX-6P-1 （+）中，经双酶切和PCR鉴定，可见得到两条与预 期相对分子质量相符合的条带，载体和目的基因的 相对分子质量分别为4.9 Kb及0.251 Kb，见图2。 2.3 目的蛋白的表达和纯化

图 2 GpGEX-6P-1 /GAGE-1重组质粒PCR和酶切分析 Figure 2 PCR and restriction analysis of pGEX-6P-1/ GAGE-1 recombinant plasmid

转化重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导，裂解 后进行SDS-PAGE分析，得到一条分子量约35.7 kD 的条带，符合除去GST 蛋白(约26 kD）后251 bp片 段所编码的氨基酸的相对分子质量9.7 kD，见图3~6，蛋白纯度达90%以上。将上一步得到的洗脱 液经过SuperdexG75精制，只有一个峰，分瓶收样 (F1-F5)，F1和F2是峰尖以前的部分，比较干净， 其余部分舍弃。将收集的F1和F2进行电泳，结果 得到了比较纯的条带，见图6。

图 3 重组质粒破菌后过柱前电泳图 Figure 3 The electropherogram of recombinant plasmid broken bacteria prior to the column transiting

图 4 重组质粒破菌后过GST柱纯化电泳图 Figure 4 The electropherogram of recombinant plasmid purified by GST

图 5 洗脱液经过SuperdexG75精制后电泳图 Figure 5 The electropherogram of the eluent purified by SuperdexG75

图 6 GAGE-1融合蛋白亲和层析纯化后电泳图 Figure 6 The electropherogram of GAGE-1 fusion protein purification by affinity chromatography

近年来，随分子生物学、免疫学、基因工程 技术等多学科的交叉发展，以及多种肿瘤抗原的陆续发现，肿瘤免疫治疗已经成为国际上肿瘤治 疗的热点之一 。肿瘤免疫治疗的关键是找到肿瘤 相关或肿瘤特异性抗原。GAGE基因属于癌-睾丸 抗原之一，于1995年首次被鉴定^[2]以来已陆续发 现GAGE基因至少包含十几个以上的家族成员。 GAGE基因的功能目前还不明确，但已证实其在多 种肿瘤中有不同频率的表达。GAGE蛋白因可引起 机体产生细胞和体液免疫，被认为是目前免疫原 性较强的肿瘤抗原之一而备受关注^[9]。

本研究运用GAGE-1引物从人肝癌细胞株 QGY-7701中扩增GAGE-1 5'端251 bp片段，接着将 GAGE基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,酶 切及测序鉴定正确后转化BL21（DE3）表达菌， 通过IPTG诱导表达,经GST柱纯化，最终获得GSTGAGE-1融合蛋白。本实验发现，初次过GST柱的 蛋白杂带较多，可能是由于GST-GAGE-1融合蛋白 少部分发生了降解，从而产生了分子量介于GST 和GAGE-1之间的降解产物。为了得到比较纯化的 GST-GAGE-1融合蛋白，实验进一步将非还原型洗 脱液通过SuperdexG75精制，然后分瓶收集不同峰 段的洗脱液，发现F1和F2是峰尖以前的部分，比较 干净，其余部分舍弃，接着将收集的F1和F2进行电 泳分析，得到比较纯化的GST-GAGE-1融合蛋白。

实验选用BL21（DE3）大肠杆菌作为宿主细 胞对目的基因进行原核表达，主要是考虑BL21 （DE3）缺乏纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶和 ompT外膜蛋白酶，所表达的目的蛋白有较高的稳 定性。表达出来的蛋白经多次优化后，仍以不溶 性的包涵体形式存在，为使其恢复生物学活性， 继而采用透析法复性，将变性的蛋白质经过透 析，通过逐渐降低外透液浓度，缓慢去除变性剂 使目的蛋白恢复到正常的折叠结构^[10]。本实验所 表达的蛋白含GST标签，通过GST亲和层析可以方 便得到较高纯度的融合蛋白。

前期研究表明GAGE基因在广西肝细胞癌中有 较高频率的表达，且在一些AFP阴性肝癌中出现 GAGE阳性表达的现象^[8]，但GAGE是否参与肝癌 细胞的增殖、转移、凋亡等过程，目前尚未见报 道。由于反义核酸、突变体及载体的制备相对困 难，技术也较为复杂，使GAGE在临床诊断和治疗 的实际应用价值还难以实现。因此，利用基因工 程的方法在BL21（DE3）大肠杆菌中进行诱导表 达，制备并纯化出GAGE-1融合蛋白有一定的研究 和应用价值。本研究将进一步验证纯化的GAGE-1 融合蛋白的免疫原性，并进一步探讨通过添加免 疫佐剂等方法来提高GAGE-1蛋白的临床疗效。此 外，还拟将GAGE-1融合蛋白作为肝癌相关抗原致 敏树突状细胞，继而观察后者诱导的特异性CTL 对肝癌细胞的杀伤作用。故本实验表达的融合蛋 白为进一步研究GAGE-1抗原在肝癌免疫治疗中的 作用奠定了实验基础。