结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界 与肿瘤相关的死因中位居第四^[1]。近几十年来奥沙 利铂和伊立替康的应用以及新型分子靶向治疗药物 的出现使结直肠癌的治疗取得了重大进步，其生存 率有了显著提高。目前结直肠癌的治疗药物包括传 统的细胞毒药物（如5-Fu、奥沙利铂、伊立替康） 和分子靶向治疗药物（如西妥昔单抗、贝伐珠单 抗、帕尼单抗）。以奥沙利铂为基础的FOLFOX或 XELOX方案和以伊立替康为基础的FOLFIRI方案 均是晚期结直肠癌的标准化疗方案^{[2, 3]}。

不同研究显示在25%~80%的结直肠癌中检测 到表皮生长因子受体（EGFR）的表达增高^[4]，这 使之成为结直肠癌分子靶向治疗最主要的靶点之 一。其中西妥昔单抗是一种靶向作用于EGFR的重 组人鼠嵌合型单克隆抗体，它与表皮生长因子及 其他配体竞争性结合EGFR胞外结构域。西妥昔单 抗作为结直肠癌治疗中最有效的靶向药物之一在 临床上已获得广泛使用^[5]。

为了进一步提高结直肠癌药物治疗效果，人 们开始尝试将细胞毒药物与分子靶向治疗药物联 合使用。近年来，国际上开展了多项大型临床试 验，以评价常用细胞毒药物与西妥昔单抗联用治 疗转移性结直肠癌的疗效。其中BOND研究是在 伊立替康耐药的转移性结直肠癌患者中,比较伊 立替康联用西妥昔单抗与单用西妥昔单抗治疗的 疗效，结果显示联合使用组的反应率、疾病控 制率和中位无进展生存时间均得到明显提高^[6]。 CRYSTAL研究证实，一线使用西妥昔单抗联合含 伊立替康的化疗方案能有效提高kras基因野生型转 移性结直肠癌患者的无进展生存率和总生存率^[7]。 然而，针对结直肠癌治疗中另一个最常用的化疗 药物奥沙利铂，其与西妥昔单抗联用的临床试验 却未能取得一致结果。早期的Ⅱ期临床实验OPUS 研究报道，含奥沙利铂的化疗方案（FOLFOX4） 与西妥昔单抗联用能显著提高kras基因野生型转 移性结直肠癌患者的无进展生存期和反应率^[8]。 但这一结果在之后的两项Ⅲ期临床实验COIN和 NIRDIC-Ⅶ研究中却未能得到证实，联用西妥昔单 抗并不能给使用含奥沙利铂化疗方案的晚期结直 肠癌患者带来更大获益^{[9, 10]}。这些矛盾的研究结果 使目前两药的联用出现争议，而以结肠癌细胞系 进行为数不多的两药联用的体内外研究，也得到 了协同和拮抗两种相反结果。这些试验结果背后 的两药联合相互作用机制来自于奥沙利铂的药理 作用与EGFR信号通路间的交叉作用，为此本文将 对两药各自的相关作用机制及其联合作用机制进 行综述。 1 奥沙利铂与西妥昔单抗作用机制 1.1 奥沙利铂的药理作用 奥沙利铂是第一个在结肠癌治疗中被证实 有效的铂类药物。与其他铂类药物的作用机制 一样，奥沙利铂通过与DNA的相互作用，形成 铂-DNA加合物，阻止转录因子与DNA的结合以抑 制基因的转录，而且造成DNA的链内、链外及与 蛋白质的交联，从而阻断了DNA的复制，导致细 胞周期阻滞和细胞死亡^{[11, 12]}。铂类药物还通过氧化 应激反应生成过氧化氢等活性氧自由基（ROS） 产生细胞毒性^[13]。尽管上述作用使奥沙利铂成为 结直肠癌治疗中最有效的药物之一，但细胞中天然 存在谷胱甘肽转移酶对奥沙利铂的解毒作用和清 除铂类对DNA损伤的DNA修复作用。包括奥沙利 铂在内的大部分抗癌药物都在一定程度上通过提 高细胞内ROS的含量杀死靶细胞，谷胱甘肽系统则 通过调节ROS的生成限制奥沙利铂的毒性^[14]。DNA 修复中的核苷酸切补修复作用是细胞内清除奥沙利 铂-DNA加合物的主要方法，其中核苷酸切除修复 交叉互补集团1（ERCC1）是产生铂-DNA加合物5ˊ 端切口的关键酶^{[15, 16]}。这种解毒或修复作用的增强 还能引起肿瘤细胞对奥沙利铂耐药。 1.2 西妥昔单抗与EGFR信号通路

西妥昔单抗是一种针对 EGFR的单克隆抗 体。EGFR属于受体酪氨酸激酶家族，参与EGFR 通路的信号转导以调节细胞的生长、分化和增 殖。活化的EGFR将信号传导至下游信号通路， 激活有丝分裂及存活通路，如丝裂原活化蛋白激 酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K/AKT） 通路。西妥昔单抗以高亲和力与配体竞争性结合 EGFR并阻滞其磷酸化，从而抑制MAPK及PI3K/ AKT等通路，最终造成细胞凋亡、增殖抑制、基 质金属蛋白酶及血管表皮生长因子减少。西妥昔 单抗还通过介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作 用(ADCC)杀伤肿瘤细胞。在体内外实验中均证实 其对表达EGFR的人结肠癌细胞增殖及裸鼠移植瘤 模型的肿瘤生长具有抑制作用^[17]。研究还表明， 西妥昔单抗与多种化疗药物具有协同作用，其中 包括另一种常用铂类药物——顺铂^{[18, 19]}。然而，当 EGFR下游信号通路中kras发生突变导致KRAS蛋 白呈现自磷酸化的持续激活状态时，西妥昔单抗 对上游EGFR的阻滞无法抑制下游蛋白的激活，会 出现西妥昔单抗耐药，这种耐药现象已在多项临 床试验及体内外研究中得到证实^{[20, 21, 22]}。 2 奥沙利铂与西妥昔单抗联用后相互作用机制 2.1 联用增效机制 2.1.1 奥沙利铂联用西妥昔单抗后增加细胞周期 阻滞和促进凋亡

在两药协同作用中周期阻滞作用增强且凋亡 提前。通过将奥沙利铂和西妥昔单抗联用有协同 作用的HCT-8和无协同作用的HCT-116人结肠癌细 胞系进行比较发现，在有协同作用的细胞中联用 较两药分别使用，G1及G2/M期细胞比例增高，S期 比例减低。通过荧光染色观察用药后两种细胞的 形态学变化还发现，在有协同作用细胞中两药联 用后出现核固缩与核裂解的时间较单用奥沙利铂 明显提前，在无协同作用细胞中联用后未发现上 述改变。由于PI3K/AKT信号通路是EGFR调节细 胞凋亡的关键通路，进一步研究发现在有协同作 用细胞中奥沙利铂作用后p-AKT的表达增加，联 合西妥昔单抗后则明显降低，而在无协同作用细 胞中无此差别，表明西妥昔单抗增强奥沙利铂诱 导凋亡的作用可能与其抑制AKT磷酸化有关^[23]。 当西妥昔单抗阻滞EGFR下游通路后，凋亡相关蛋 白BAX和Caspase-8表达增加，并下调BCL-2及NF- κB的表达，这可能使细胞对奥沙利铂造成的凋亡 刺激更加敏感^[24]。 2.1.2 西妥昔单抗抑制核苷酸切补修复作用及基 本切除修复作用以增强奥沙利铂对DNA的损伤

多项研究发现奥沙利铂与西妥昔单抗联用后 细胞内铂-DNA加合物的含量较单用奥沙利铂显 著增加，且只发生在联用有协同作用的细胞中。 铂-DNA加合物被认为是铂复合物发挥细胞毒性 的主要原因，且与奥沙利铂的抗肿瘤作用密切相 关。奥沙利铂引起的DNA损伤除了铂-DNA加合 物外，还有另一种尚未被深入研究的损伤形式， 即无嘌呤或无嘧啶DNA损伤。在联用增效的细胞 中奥沙利铂与西妥昔单抗联合作用后无嘌呤或无 嘧啶位点较奥沙利铂单药亦明显增加，其含量与 奥沙利铂的细胞毒作用呈正相关。在西妥昔单抗 单药作用时并不会造成上述DNA损伤，这说明西 妥昔单抗增强了奥沙利铂对DNA的这两种损伤作 用。

进一步研究发现在细胞中减弱奥沙利铂毒性作 用的两种主要机制中，谷胱甘肽的解毒作用并无改 变，但DNA修复作用被明显削弱。由于西妥昔单 抗阻滞的EGFR通路下游的信号分子ERK1/2参与了 对核苷酸切补修复机制中关键酶ERCC1的调节， Prewett等^[12]以此进一步研究证实西妥昔单抗通过 抑制ERK1/2与AKT的磷酸化，从而下调ERCC1及 核酸酶XPF的表达。Balin-Gauthier等^[23]则发现此 过程中ERCC1在转录和翻译水平均发生下调。此 外，还发现西妥昔单抗对细胞内另一种切补修复机 制基本切除修复也具有抑制作用，这主要是通过 减少X线交叉互补修复集团1（XRCC1）的表达来 实现的，该蛋白在基本切除修复机制中发挥着重要 作用，该修复机制被认为在无嘌呤或无嘧啶DNA 损伤的修复中起关键作用^[25]。

同时，DNA损伤的增加也可能成为上述联用 后增强细胞周期阻滞作用的原因。因为仅在联用 有协同作用的细胞中发现调节DNA复制起始的主 要蛋白Claspin、CDC45和CDC6表达下调，这表明 产生协同作用时铂-DNA加合物的增加能对DNA的 复制起始发挥更强的抑制作用，从而使细胞被阻 滞在G1期，且S期细胞减少^[23]。 2.1.3 奥沙利铂增加EGFR表达

另一方面，奥沙利铂对西妥昔单抗也表现出 增敏作用。最近多项研究发现奥沙利铂等化疗药 物作用后能提高结肠癌细胞的EGFR表达水平。其 中一项研究发现经不同浓度奥沙利铂诱导耐药后 的结肠癌细胞EGFR的表达水平增高，且诱导药物 浓度越高，增高水平越显著。更重要的是这些细 胞对西妥昔单抗的敏感度也明显提高^{[26, 27]}。由此 推测，在联用增效作用中奥沙利铂可能通过增加 EGFR表达提高西妥昔单抗的敏感度。 2.2 拮抗作用可能机制

铂类能直接在无细胞系统中与DNA相互作用 生成活性氧自由基（ROS）。因此在西妥昔单抗 与奥沙利铂的协同作用中铂-DNA加合物的增加 可能使ROS也随之增多。然而，在结肠癌细胞系 HT-29 D4中却因为联用后ROS的生成减少产生拮 抗作用^[28]。

Dahan等^[28]通过测定HT-29 D4细胞内ROS最主 要的形式之一——过氧化氢的含量，发现与不加 药组比较，加西妥昔单抗后其含量减少，加奥沙 利铂后明显增加，而两药联用后则较单用奥沙利 铂显著减少。由于 ROS的生成是NAPDH的主要 功能之一，其中NOX1是NAPDH氧化酶复合体的 催化亚基^{[29, 30]}。同时，在多种细胞中EGFR能活化 NAPDH^[31]。由此进一步的探究联用后ROS减少的 原因发现，在HT-29 D4中抑制NOX1表达使ROS生 成减少后奥沙利铂的细胞毒作用明显减弱，在加 入过氧化氢酶催化分解ROS时同样降低了奥沙利 铂的细胞毒作用。这提示在两药拮抗作用中，西 妥昔单抗通过抑制EGFR信号通路，使NOX1表达 下调，从而减少了ROS的生成，降低了奥沙利铂 的作用效力^[28]。 2.3 指示联用效果的分子标志物

在不同细胞系中联用奥沙利铂和西妥昔单抗 存在上述不同的作用机制，并出现不同的联用效 果，可能是由于不同细胞系的基因背景和蛋白表 达水平的差异，这也提示我们可以通过寻找有效 的分子标志物来预测两药的联用效果。有研究通 过将奥沙利铂与西妥昔单抗联合作用于四种具有 不同EGFR表达水平的结肠癌细胞，发现联用后在 低度及中度表达EGFR的结肠癌细胞系中表现出 协同作用，但在不表达及高度表达EGFR的结肠癌 细胞系中无此协同作用。在上述四种细胞系的裸 鼠移植瘤模型实验中也得到与体外实验一致的结 果。这说明两药联用的效果与EGFR表达水平并 无相关性。进一步研究这四种细胞的基础磷酸化 EGFR（p-EGFR）表达量、总的及磷酸化MAPK、 AKT表达水平发现，这种协同作用仅与细胞基础 p-EGFR表达相关，p-EGFR表达水平越高，两药联 用后协同作用越显著^[32]。另一项研究则在结肠癌 细胞系中对表达野生型kras的HT-29 D4、CACO-2 细胞和突变型kras的SW480、SW620细胞分别联用 奥沙利铂和西妥昔单抗，结果在这四种细胞中均 出现两药拮抗作用，且在kras野生型细胞中拮抗作 用更加显著。当HT-29 D4细胞转染kras G12V 突变 后联用西妥昔单抗时拮抗趋势减弱。这表明kras突 变可能抑制两药的拮抗作用^[28]。p-EGFR表达水平 和kras突变的预测价值还有待在更多结肠癌细胞系 实验和临床试验中验证。 3 展望

目前关于是否应该在结直肠癌治疗中将奥沙 利铂和西妥昔单抗联合使用，还没有足够的临床 数据能做出解答，甚至临床前研究也得到相反的 结果。基础研究结果发现在一部分结肠癌细胞 中，西妥昔单抗能通过抑制ERK1/2和AKT通路等 使奥沙利铂表现出更强的细胞周期阻滞、诱导凋 亡和DNA损伤作用，而奥沙利铂也可能增加细胞 EGFR的表达使西妥昔单抗的阻滞效果更加明显， 这些机制使两药联用发挥协同作用。但对另一部 分结肠癌细胞，西妥昔单抗因为抑制ROS的生成 而拮抗奥沙利铂的作用。有研究发现两药联合在 不同的细胞上究竟会表现出增效抑或拮抗作用与 细胞基础p-EGFR表达或kras的突变状态有关。基 于目前的临床和临床前研究结果，在不同人群和 细胞系中两药联用通过不同的作用机制表现出不 同的效果，提示可能在DNA修复作用或ROS生成 途径与EGFR通路交叉点上存在某些关键信号分 子，它们的状态决定两药相互作用的主要表现形 式。这些信号分子同时也能作为标志物预测联用 的疗效。

西妥昔单抗作为一种生物制剂，在体内能发 挥抗体、补体介导的细胞毒作用，甚至包括增强 树突状细胞的吞噬作用和抗原特异性细胞毒性T 细胞反应都是西妥昔单抗在体内发挥疗效的重要 途径。已经发现多种化疗药物能增加西妥昔单抗 介导的ADCC作用^{[26, 33]}。因此两药联用对免疫作 用的影响也有必要加以研究。另外，在临床上奥 沙利铂与西妥昔单抗联用的同时通常也使用化疗 药5-Fu，该药是否参与了奥沙利铂与西妥昔单抗 联合的相互作用，甚至使两者之间作用方式发生 重大改变，也是值得进一步开展体内外研究的方 向。