Raf激酶抑制蛋白(RKIP)与乙酰肝素酶(HPA) 在多种肿瘤组织中均异常表达，并发现两者均与 多种恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关，目前HPA 表达的调控机制不清，从理论上推测可能与RKIP 表达有关。本实验旨在研究RKIP与HPA在肝细胞 癌、癌旁肝组织及正常肝组织中的表达情况，并 分析两者的相关性。 1 资料与方法 1.1 资料

1.1.1 组织标本

本研究所用标本为2010年1月至 2010年10月河北医科大学第四临床医院肝胆外科 手术切除并经病理证实的肝细胞癌42例，癌旁组 织36例（均取自距肿瘤边缘1~2 cm的非肿瘤组 织），正常肝组织23例（均取自肝血管瘤等肝良 性肿瘤周围的正常肝组织）。所有标本均经10%中 性福尔马林溶液固定，石蜡包埋保存。 1.1.2 主要试剂

兔抗人HPA多克隆抗体，山羊抗 人RKIP多克隆抗体，辣根过氧化物酶(HPR)兔抗 山羊IgG抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 抗体，即用型两步法免疫组织化学试剂盒，二氨 基联苯胺(DAB)试剂盒等。 1.2 方法

石蜡包埋的组织标本做4 μm连续切片，每例 切取5张，1张行HE染色，不加RKIP及HPA相应 抗体对照各一张，余下两张分别加入RKIP及HPA 抗体，运用免疫组织化学两步法进行染色。结果 采用双评分半定量法进行评分，染色强度评分标 准：不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色 3分。阳性细胞所占比例评定标准：阳性细胞比 例<25%为0分，25%~50%为1分，>50%~75%为2 分，>75%为3分。两种评分相加，0~1分为阴性 (-)，2分为弱阳性(+),3~4分为阳性(++)，5~6分为强 阳性(+++)。 1.3 统计学方法

所有运算均采用SPSS 13.0统计学软件进行分 析，肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织之间RKIP 和HPA的表达差异采用秩和检验，肝癌组织中 RKIP和HPA的表达差异采用Spearman等级相关检 验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 肝癌组织中RKIP的表达结果

肝癌中RKIP的 表达水平显著低于癌旁及正常肝组织，而HPA的 表达水平显著高于癌旁及正常肝组织，见表 1，图 1、2。

表 1(Table 1)

表 1 RKIP、HPA在肝癌、癌旁组织及正常肝组织中的表达 Table 1 Expression of RKIP and HPA in HCC,tumor-surrounding and normal liver tissue

表 1 RKIP、HPA在肝癌、癌旁组织及正常肝组织中的表达 Table 1 Expression of RKIP and HPA in HCC,tumor-surrounding and normal liver tissue

图 1RKIP在肝癌组织中的阴性表达（IHC ×400） Figure 1Negative expression of RKIP protein in HCC （IHC ×400）

图 2HPA在肝癌组织中的阳性表达（IHC ×400） Figure 2Positive expression of HPA protein in HCC（IHC ×400）

在肝细胞癌组织中RKIP和HPA的表达呈显著负相关(r=﹣0.409,P=0.007)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 RKIP与HPA在肝癌组织中表达的相关性 Table 2 Correlation between the expression of RKIP and HPA in HCCs

表 2 RKIP与HPA在肝癌组织中表达的相关性 Table 2 Correlation between the expression of RKIP and HPA in HCCs

RKIP属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的成员^[1], 多项研究表明RKIP在多种恶性肿瘤中表达的下调 或缺失，且对Raf-1/MEK /ERK、NF-κB以及G蛋白 偶联受体等多条信号通路的调控发挥着重要作用^{[2, 3, 4]}, 这些信号通路不仅参与了细胞的生长、增殖以及 分化，而且与肿瘤的侵袭转移密切相关。

HPA是目前发现的生物体内唯一可以降解硫 酸乙酰肝素活性的葡萄糖醛酸内切酶，它通过特 异性识别并切断硫酸乙酰肝素蛋白的多糖侧链来 降解细胞外基质和血管的基底膜,并且通过释放和 活化肝素结合型的生长因子(如Bfgf、VEGF等)诱 导血管生成，从而为恶性肿瘤的侵袭转移创造条 件。

本实验研究表明，RKIP的低表达或缺失与 HPA的过表达均与肝癌的侵袭转移有关，且两者 在肝癌组织中的表达呈显著负相关。由于RKIP参 与包括Raf-1-MEK1/2-ERK1/2、NF-κB等多条通路 的信号转导，且这些信号通路均与肝癌的侵袭转 移有关，那么可以猜想，RKIP可能是通过某条通 路抑制肝癌组织中HPA的表达。

在动物体内，Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2级联 通路可以将促有丝分裂和分化信号从细胞膜传递 到细胞核。该通路中Raf、MEK、ERK激酶依次被 磷酸化，从而构成一个三级酶联反应。Yeung等^[4] 发现RKIP通过结合Raf-1和MEK，使ERK不能激 活，减少P-ERK的表达，从而抑制Raf-1-MEK1/2- ERK1/2信号的转导。de Mestre等^[5]用ERK通路抑制 剂明显降低Hpa基因表达水平，可以推测，RKIP可 能是通过抑制ERK的激活来抑制HPA的表达。

NF-κB是一个转录因子蛋白家族，当细胞受细 胞外信号刺激后，IκB激酶复合体(IκB kinase,IKK) 活化将IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位点。 游离的NF-κB迅速移位到细胞核，与特异性κB序 列结合，诱导相关基因转录。Yeung等^[3]实验得出 RKIP能与IKKα和IKKβ相互作用，抑制IκΒ的磷酸 化，从而抑制NF-κB信号通路。Andela等^[6]首先建 立小鼠肺泡细胞癌模型，然后对该模型进行研究 后发现，阻断NF-κB信号通路，可以下调HPA的表 达。所以我们可以分析，RKIP可能通过阻断NF- κB信号通路，下调HPA的表达。

综上所述，RKIP与HPA均与肝癌的侵袭转移 密切相关，实验表明RKIP与HPA呈显著负相关， RKIP作为多条信号通路的调节因子，可能通过 Ras/Raf/ERK或NF-κB信号通路抑制HPA的表达， 但具体机制有待我们进一步研究。