肺癌是一种严重威胁人类健康的疾病，已成 为我国首位肿瘤死亡病因^{[1, 2]}，探索和研究肺癌 诊断和治疗的新方法与新策略，是一项紧急的任 务，藉此提高肺癌患者生存率，改善预后^{[3, 4]}。 microRNAs(miRNAs)是近年来肿瘤领域的研究热 点^[5]。现已发现miRNA在肿瘤的发生发展中发挥 关键作用^[6]。miRNA-182是2003年发现的miRNA 家族的成员，有24个碱基序列，其与肿瘤增殖和 凋亡密切相关，行使着“癌基因”功能^{[7, 8]}。在多种 肿瘤患者中，可以检测到异常表达的miR-182，但 miR-182与肺癌的关系少有报道。

本研究检测miR-182在肺癌细胞中的表达情 况，并观察miR-182对靶基因PFN1表达以及对肺 癌细胞生物学特性的影响，为肺癌治疗提供新方 法和新策略。 1 材料与方法 1.1 主要试剂

人肺癌细胞株A549、95-D以及正常支气管 上皮细胞HBE 购自中国科学院细胞库。胎牛血 清、DMEM 培养液、F12K培养液、RPMI1640培 养液、L-谷氨酰胺、Lipofectamine 2000购自美国 Invitrogen公司。

TaqMan miRNA Isolation Kit、TaqMan microRNA Assay kit和TaqMan microRNA Assay and TaqMan Universal PCR Master Mix 购自于Applied Biosystems公司。miR-182抑制剂(miRIDIAN microRNA Hairpin inhibibitor)和阴性对照(a nontargeting sequence)购自Dharmacon公司。

胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液( P B S ) 、 MTT [3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide] 购自美国Sigma-Aldrich公 司。细胞培养板或培养皿、Transwell 侵袭小室 购自Corning公司。Matrigel胶购自BD Bioscience 公司。Annexin Ⅴ和碘化丙啶（propidium iodide, PI）购自Roche公司。兔抗人PFN1多克隆抗体和小 鼠抗人β-actin单克隆抗体购自英国Abcam公司。二 抗为IRDye 800 conjugated affi nity purifi ed goat antimouse IgG和IRDye 800 conjugated affinity purified goat anti-rabbit IgG购自Odyssey公司。蛋白抽提及 定量试剂盒购自Bio-Rad公司。pGL3-Lueiferase载 体、荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司。 1.2 方法 1.2.1 人肺癌细胞株的培养

HBE细胞用含10% 胎牛血清的DMEM 培养 液，在37℃、5%CO₂饱和湿度条件下进行培养。 A549细胞培养于含2 mM L-谷氨酰胺和10%胎牛 血清的F12K培养液中，在37℃、5% CO₂饱和湿度 条件下进行培养。95-D（高转移肺癌细胞）细胞 培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，在 37℃、5% CO₂饱和湿度条件下进行培养。倒置显 微镜下观察细胞生长状态，细胞生长呈70%～80% 融合时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，隔日换液， 每3～4天传代1次。收集对数生长期细胞进行实 验。 1.2.2 qRT-PCR法检测miR-182在肺癌细胞中的表 达情况

收集体外培养的A549、95-D和HBE细胞， 以TaqMan miRNA分离试剂盒提取RNA，采用 TaqMan microRNA Assay和TaqMan Universal PCR Master Mix来检测miR-182的表达，以U6作为内 参基因。所有反应均设立3个复孔。记录每个反 应管中标本的CT 值， 实验结果采用qRT-PCR中 的相对定量法进行分析， 以2^-ΔΔCT表示肺癌细胞 中miR-182表达量相对于HBE细胞表达量的变化 倍数，其中ΔΔCT=(CTmiR-182-CTU6)Lung cancer cell- (CTmiR-182-CTU6)HBE。 1.2.3 检测肺癌细胞中转染miR-182抑制剂对 miR-182表达的影响

正常培养的95-D细胞，以3×10⁵个/毫升均 匀接种于6孔培养板，每孔体积1 000 μl。待细 胞贴壁后，按Lipofectamine 2000转染说明书进 行miR-182抑制剂(miR-203 inhibitor)和阴性对 照(negative control)的转染。同时设正常对照组 (untransfected)。转染48 h。以TaqMan miRNA分离 试剂盒分别提取各组细胞的RNA，采用qRT-PCR 方法检测各组细胞中miR-182表达变化。 1.2.4 MTT法检测miR-182对细胞活力的影响

正常培养的95-D细胞， 以3×10⁵个/ 毫升 均匀接种于96孔培养板，每孔体积100 μl。按 Lipofectamine 2000转染说明书进行miR-182抑制剂 和阴性对照的转染。同时设正常对照组。转染48 h 后，每孔加 100 μl MTT（0.5 mg/ml）溶液，放入 37℃、5% CO₂培养箱中培养4h。每孔加入100 μl 20% SDS（助溶剂50%二甲基甲酰胺），37℃作用 24 h。酶标仪（美国Bio-Tek公司）于570nm处测 定OD值。在每个实验组设10个复孔，实验重复3 次。 1.2.5 流式细胞仪检测miR-182对细胞增殖的影响

正常培养的95-D细胞，以3×10⁵个/毫升均 匀接种于6孔培养板，每孔体积1 000 μ l。按 Lipofectamine 2 000转染说明书进行miR-182抑制剂 和阴性对照的转染。同时设正常对照组。转染48 h后，PBS清洗细胞1~2次，胰蛋白酶消化细胞， PBS清洗细胞2次后，离心收集细胞，加入PI染 液，4℃避光标记30 min，筛网过滤后，流式细胞 仪分析（美国BD公司）检测，FCM cellQuest软件 计数细胞，Macquit软件分析数据。 1.2.6 流式细胞仪检测miR-182对细胞凋亡的影响

细胞转染miR-182抑制剂和阴性对照 48 h后， PBS清洗细胞1~2次，加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染 液，室温避光标记15 min，筛网过滤后，流式细胞 仪分析（美国BD公司）检测，FCM cellQuest软件 计数细胞，Macquit软件分析数据。 1.2.7 Transwell侵袭小室检测miR-182对细胞迁移 的影响

正常培养的95-D细胞，以3×10⁵个/毫升均 匀接种于6孔培养板，每孔体积1 000 μ l。按 Lipofectamine 2000转染说明书进行miR-182抑制剂 和阴性对照的转染。同时设正常对照组。将转染 24 h后95-D细胞接种于Transwell侵袭小室，正常条 件培养24 h后，PBS清洗细胞1~2次，0.1%结晶紫 染色。Leica显微镜下计数穿过Transwell聚碳酸酯 膜的细胞数。穿过Transwell聚碳酸酯膜的细胞为 侵袭的细胞，随机观察8个视野。 1.2.8 荧光素酶报告基因系统检测PFN1基因

构建荧光素酶质粒：化学合成包含有与相应 miR-182互补结合的靶基因PFN1 3’-UTR序列片 段，将包含预测miR-182结合位点的PFN1 3’-UTR 的片段克隆进pGL3-Lueiferase载体的XbaⅠ位点。

正常培养的95-D细胞，以3×10⁵个/毫升均匀接 种于6孔培养板，每孔体积1 000 μl。共转染包含 PFN1 3’-UTR的荧光素酶质粒，以及miR-182抑制 剂或阴性对照。同时设正常对照组。转染48 h后 收集细胞并使用荧光素酶试剂盒检测，酶标仪读 数。

相同的转染方法，转染48 h后，收集各组细胞 蛋白，采用Western blot 法测定细胞中PFN1蛋白表 达。

6孔细胞培养板，每孔加入1 ml的RIPA 裂解液 [150 mM NaCl,1% NP40,0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS,50 mM Tris (pH 7.9),10 mM NaF,10 mM PMSF and 1×protease inhibitors (Complete cocktail tablets,Roche)]，将细胞裂解液转移至1.5 ml离心 管，16 000g离心30 min，取上清液，用BCA法测 上清蛋白浓度。灌制5%的浓缩胶和15%的分离 胶，每泳道加总蛋白量50 μg，进行电泳分离,经 湿转印到PVDF 膜上（Bio-Rad公司,美国），在含 有5%脱脂奶粉的TBST（10 mM Tris–HCl,pH7.5, 150 mM NaCl,和0.1% Tween-20）溶液中常温封闭 1 h，然后分别加入兔抗人PFN1多克隆抗体(1:500 稀释)及小鼠抗人β-actin单克隆抗体(1:1 000稀释)， 4℃孵育过夜，然后加入IRDye 800相应标记的二 抗（1:2000稀释于PBS）， 4℃孵育过夜，TBST 洗涤，Odyssey红外成像系统（Rockland公司）扫 描。PFN1的相对含量用PFN1/β-actin灰度比值表 示，灰度采用QuantityOne软件（Bio-Rad公司，美 国）分析。 1.3 统计学方法

采用SPSS17.0 统计分析软件对实验数据进行统 计学处理，两组比较采用t检验，两组以上数据比较 用方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 miR-182在人肺癌细胞中的表达情况

qRT-PCR的结果显示：miR-203在肺癌细胞系 A549、95-D中的表达显著高于其在HBE细胞中的 表达（P<0.01），见图 1A。

图 1miR-182的表达检测及对细胞活力的影响 Figure 1The expression of miR-182 and effects of miR-182 on cell viability A: the expression of miR-182 in lung cancer cells A549,95-D and normal human bronchial epithelial cell (HBE),**:P<0.01 versus HBE group; B: the miR-182 inhibitor affected the expression of miR-182 in lung cancer cell 95-D,**:P<0.01 versus untransfected group; C: the MTT assay results indicated the role for miR-182 on the viability of 95-D cells,*:P<0.05 versus untransfected group

前一个研究结果显示：miR-182在高转移性 肺癌细胞95-D中表达水平最高，因此以下就选择 95-D细胞进行进一步研究。通过在95-D 细胞中转 染miR-182抑制剂，抑制miR-182表达。qRT-PCR 的结果显示：miR-182抑制剂转染组中miR-182的 表达显著低于正常对照组(untransfected)(P<0.01)。 结果见图 1B。 2.3 miR-182对细胞活力的影响

MTT分析结果显示：miR-182抑制剂转染组中 细胞活力低于正常对照组(untransfected)(P<0.05)。 结果见图 1C。结果说明，抑制miR-182的表达降低 了细胞活力。 2.4 miR-182对细胞增殖的影响

增殖指数(proliferation index,PI）=(S+G₂M)/ (G₀G₁+S+G₂M)。流式细胞仪分析结果显示： miR-182抑制剂转染组中细胞增殖指数低于正常对 照组(untransfected)(P<0.05)，见图 2A。

图 2miR-182对细胞增殖、凋亡和迁移的影响 Figure 2Effects of miR-182 on cell proliferation,apoptosis and migration A: the flow cytometry assay suggests a role of miR-182 in cell proliferation of 95-D cell,*:P<0.05 versus untransfected group; B: the role for miR-182 in apoptosis suggested by fl ow cytometry results,**:P<0.01 versus untransfected group?? C: Transwell chamber assay revealed the role of miR-182 in cell migration,*:P<0.05 versus untransfected group;1:untransfected;2:miR-182 inhibitor;3:negative control

流式细胞仪分析结果显示：miR-182抑制剂 转染组中凋亡细胞百分比显著高于正常对照组 (untransfected)(P<0.01)，见图 2B。结果说明，抑制 miR-182表达促进了细胞凋亡。 2.6 miR-182对细胞侵袭的影响

95-D细胞转染miR-182抑制剂和阴性对照 48h后，Transwell侵袭小室检测各组细胞侵袭 能力的变化。结果显示：转染miR-182抑制剂 后，穿过Transwell小室的95-D细胞数明显降低 （P<0.05）。说明了抑制miR-182表达，抑制了 95-D细胞的侵袭,见图 2C。 2.7 荧光素酶报告基因系统检测结果

为了验证miR-182的预测靶点位于PFN1 3’-UTR，我们构建包含PFN1 3’-UTR的荧光素酶 质粒并将其与miR-182抑制剂和阴性对照共转染 95-D细胞。结果表明与正常对照组(untransfected) 相比，miR-抑制剂转染组中质粒的荧光素酶活性 明显降低（P<0.05），见图 3。结果表明miR-182 直接作用于PFN1 3’-UTR的预计靶位点。Western blot检测结果显示：miR-182抑制 剂转染组中PFN1蛋白的表达显著高于正常对照 组(untransfected)(P<0.05)，见图 3。结果说明， miR-182的表达抑制了PFN1蛋白的表达。

图 3荧光素酶报告基因系统检测miR-182的靶基因及PFN 蛋白表达的检测 Figure 3The target gene of miR-182 and the expression of PFN1 protein were tested luciferase reporter gene system A: the putative miR-182 target site within the PFN1 3’-UTR was depicted; B: the statistical result of relative luciferase activity; C: Western blot depicted PFN1 protein expression in each group of 95-D cell,*P<0.05 versus untransfected group;1:untransfected;2:miR-182 inhibitor;3:negative control

以往的研究表明miRNA在肿瘤发生发展中 起重要作用^[9]。研究表明在肿瘤发生发展过程中 miRNAs出现异常表达^[10]。在癌症发生发展中能直 接促进肿瘤形成的miRNAs，发挥着类似致癌基因 功能因而被称为致癌miRNAs，如Xu等^[11]研究发 现，miR-96在结肠癌中表达上调，并与结肠癌的 肝转移相关。与此相反，在肿瘤中呈低表达或表 达缺如的miRNAs，通常发挥类似肿瘤抑制基因 功能而被称为抑癌miRNAs。Bueno等^[12]研究发现 miR-203具有肿瘤抑制功能，为特定的造血系统恶 性肿瘤的治疗提供新途径。

研究发现miR-182行使着癌基因的作用，其与 DNA损伤修复相关、调控着细胞的凋亡和增殖， 已发现其相应靶基因有FOXO1、RGS17、MITF、 FOXO3^{[13, 14]}。在多种肿瘤中如子宫内膜癌、结肠 癌、前列腺癌、卵巢癌、恶性间皮瘤和在血液疾 病中（如淋巴瘤、骨髓纤维化等患者血液中）， 均可以检测到异常上调的miR-182^{[15, 16]}。本研究 qRT-PCR结果显示：miR-182在肺癌细胞中的表达 显著高于其在正常人支气管上皮细胞HBE中的表 达（P<0.01），提示miR-182在肺癌中表达上调， 可能发挥着癌基因的作用。

miR-182调控着细胞的凋亡和增殖，参与调 节多条细胞内信号通路^[17]。Weeraratne等^[18]研究发 现，miR-182调控着成神经管细胞瘤的存活、增殖 和迁移。Kong等^[19]研究结果显示：miR-182通过调 节靶基因cAMP-responsive element-binding protein 1 (CREB1)而抑制人胃腺癌细胞的生长。Poell等^[20]研 究发现，miR-182可抑制人黑色素瘤细胞的活性。 在本研究中，利用MTT法、流式细胞仪分析法和 Transwell侵袭小室检测了miR-182对95-D细胞的影 响，结果显示：抑制了miR-182的表达，抑制了肺 癌细胞的活力、增殖和侵袭，促进了凋亡。

PFN1是真核细胞中广泛存在的12~15kD的小 分子蛋白质，与actin单体结合为1:1的profilin-actin 复合体调节信号依赖的actin聚合作用^[21]。研究^[22] 指出，PFN1参与多种细胞功能，包括细胞黏附和 运动，以及依赖于actin结合蛋白的细胞形态的构 成和维持。Zou等^[23]研究结果显示：过表达PFN1 可抑制MDA-MB-231细胞的增殖。在本研究中， 通过荧光素酶报告基因系统证实PFN1是miR-182 的靶基因；Western blot结果显示：抑制了miR-182 的表达促进了PFN1蛋白的表达。因此我们推断， miR-182可能通过调节PFN1蛋白的表达，而影响 肺癌细胞的活力、增殖、侵袭和凋亡。

综上所述，miR-182在肺癌细胞中表达上调， miR-182可负性调节PFN1蛋白的表达，并抑制肺 癌细胞增殖和侵袭。抑制miR-182表达或过表达 PFN1基因的治疗策略有望使肺癌患者受益。