CCL18是一种CC型的趋化因子，最早在肺 组织中被鉴定出来，来源于肺间质的巨噬细胞， 与肺纤维化相关^[1]，可以促进淋巴细胞^[2]和树突 状细胞趋化。随着巨噬细胞在肿瘤环境中功能的 研究进展^[3]，CCL18被确定为肿瘤相关巨噬细胞 （TAM）的标志，大量的研究报道TAM与肿瘤 的进展相关，与肿瘤患者的预后呈负相关。但因 为在CCL18所作用的靶细胞上没有发现CCL18的 受体，阻碍了CCL18作为一种TAM的标志，在肿 瘤微环境中的作用及作用机制的研究。我们前期 系统研究了乳腺癌微环境中TAM来源的CCL18 对乳腺癌细胞的作用，在乳腺癌细胞表面鉴定出 CCL18的受体是PITPNM3，证明CCL18促进乳腺 癌浸润迁移^[4]。本文进一步研究CCL18促进迁移的 机制，证明CCL18与乳腺癌SK-3rd细胞的表面受体 结合，引起细胞骨架的聚集，从而促进乳腺癌的 迁移，为靶向CCL18的乳腺癌治疗进一步提供实 验依据。 1 材料与方法 1.1 材料

利用从ATCC购买的乳腺癌SKBR3细胞系，经 过在化疗的压力下多次在小鼠乳腺癌脂肪垫下形成 移植瘤，构建SK-3rd细胞系；MDA-MB-231细胞购 自ATCC公司；Transwell培养板购于Cornimg公司； beta-actin抗体购于Cell signal 公司；CCL18抗体和 蛋白购于R&D 公司；CCL20购于美国Peprotechinc 公司；纤粘连蛋白购于美国Roche公司。

激光共聚焦显微镜购于德国Carl Zeiss 公司； 去卷积显微镜购于美国Applied Precision公司。 1.2 细胞培养

在完全培养液（含10%胎牛血清的DMEM）中培养SK-3rd和MDA-MB-231细胞。 1.3 免疫荧光

为了确定CCL18作用于乳腺癌细胞的部位， 我们在腔室玻片中用无血清培养液培养SK-3rd细 胞10 min，PBS洗涤后，用多聚甲醛固定15 min， PBST洗涤，用含有CCL18蛋白（20 ng/ml）的 PBS溶液，在4℃孵育乳腺癌细胞3 h，同时SK- 3rd细胞用人血白蛋白（ALB）溶液孵育为阴性 对照，PBST洗涤，室温下用封闭液（PBST加入 2%BSA）封闭1h。除去封闭液后，在PBST中加入 羊抗人CCL18一抗，4℃过夜。PBST洗涤后，加入 生物素标记的二抗室温孵育30 min，PBST洗涤， 再加入cy3标记的抗生物素的抗体室温孵育30 min， PBST洗涤，加入FITC标记的鬼笔环肽，室温孵育 30 min。移去腔室玻片的腔室，用重组的CCL18蛋 白孵育已经固定的乳腺癌细胞，然后用CCL18抗 体、荧光标记定位CCL18的结合部位，在激光共 聚焦显微镜下观察拍照。

在固定之前用CCL18、CCL20处理MDAMB- 231细胞10 min，然后多聚甲醛固定15 min， 用FITC标记的鬼笔环肽室温孵育30 min，加入含 有DAPI的抗粹灭剂后封片。在激光共聚焦显微镜 下拍片观察CCL18所引起的细胞骨架变化。 1.4 动态观察活细胞迁移实验

用纤粘连蛋白（40μg/ml，Fn）包被四联 板，4℃过夜后，把表达GFP的慢病毒载体转染入 MDA-MB-231细胞，用不依赖二氧化碳的培养液 （GIBCO 18045）悬浮细胞。按每孔5 000个细胞 加入四联板中，实验组加入CCL18蛋白（20 ng/ ml），以加入CCL20（20 ng/ml）和不加任何趋 化因子组为对照。经因子处理4 h后，用去卷积 显微镜上定位细胞并连续观察，每分钟拍摄一张 图片，共观察4 h，拍摄图片240张。独立实验重 复3次。 2 结果 2.1 CCL18与乳腺癌细胞膜表面的蛋白结合

结果表明：用CCL18处理乳腺癌SK-3rd细胞， CCL18抗体可以检测到结合在乳腺癌细胞膜表面的 CCL18蛋白；而CCL18抗体的同型IgG不能检测到 结合在细胞膜上的CCL18蛋白；对非相关蛋白人血 清白蛋白（ALB）处理的SK-3rd细胞，CCL18的抗 体不能在细胞膜上检测到CCL18蛋白，说明CCL18 抗体可以定位细胞膜上的CCL18结合蛋白，CCL18 可以与乳腺癌细胞表面蛋白结合，见图1。

图1 CCL18与乳腺癌SK-3rd细胞膜表面受体结合的免疫荧光结果 Figure 1 Immunofl uorescence assay result of CCL18 binding to the membrane receptor of breast cancer cells SK-3rd

CCL18处理乳腺癌MDA-MB-231细胞后， 细胞形成片状伪足，细胞骨架在细胞迁移的 前缘聚集，提示细胞的运动能力增强。而用 CCL18同源趋化因子CCL20处理细胞不能引起 细胞骨架的变化，说明CCL18与乳腺癌细胞表 面蛋白结合不是简单的结合，而是配体与受体 的结合，把CCL18的受体定位在乳腺癌细胞膜 表面，见图2。

图2 CCL18引起乳腺癌细胞骨架聚集免疫荧光检测结果 Figure 2 Immunofl uorescence assay result of CCL18 binding to the membrane receptor of breast cancer cells MDA-MB-231

结果每组获得图片240张，观察到CCL18作 用4 h明显引起细胞的位移，而CCL20处理的细 胞和未处理的细胞经过4 h的观察没有明显的移 动。把每组0 h图片与4 h最后一张图片对比，证 明CCL18促进乳腺癌细胞在细胞外基质纤粘连 蛋白（Fn）上的迁移，见图3。

图3 CCL18对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移作用动态观察结果 Figure 3 Dynamic observation on viable breast cancer cells MDA-MB-231 migration promoted by CCL18

趋化因子是可溶性的8~14 kDa小分子量蛋 白，根据氨基端两个保守半胱氨酸的位置把趋 化因子分为CXC、CC、CX3C和C型趋化因子^[5]。趋 化因子的受体是G蛋白耦联的七次跨膜蛋白，G 蛋白由α、β、γ三个亚基组成，现在发现的有20 种α亚基，6种β亚基、12种γ亚基。多种趋化因 子共用一个受体或者一个趋化因子与多个受体相 结合以保证生物学效应的完成。趋化因子与不同 的受体相互作用可以引起不同的生物学效应^[6]， 激活腺苷酸环化酶(AC)和磷脂酶C（PLC）。前 者是由Gαs激活、被Gαi抑制，后者由Gαq激活。 AC作用产生cAMP，PLC产生两个第二信使二酰 基甘油和肌醇1,4,5 三羟甲基氨基甲烷磷酸盐， 前者激活蛋白激酶C，后者引起细胞内钙池中的 钙外流引发细胞内钙水平升高。进一步激活磷酸 肌醇3激酶 (PI3K)和src家族酪氨酸激酶^[7]，在细 胞伸展的前缘Rac和Rho互相激活和灭活，导致 细胞迁移和趋化。

肿瘤细胞和基质细胞表达的趋化因子与肿瘤 细胞表面或基质细胞表面的受体结合，通过肿 瘤细胞与基质细胞之间的自分泌和旁分泌环促进 肿瘤的进展。通过大规模的对正常乳腺组织、 原位癌、浸润癌基因表达谱的筛查，证明微环 境中肿瘤相关成纤维细胞过表达CXCL12，与肿 瘤细胞所表达的受体CXCR4作用，可以促进肿瘤的增殖、浸润和转移。乳腺癌转移的靶器官 富含趋化因子CXCL12（SDF-1），迁移的乳腺 癌细胞表达相关的受体CXCR4 ，CXCR4的中和 性抗体可以抑制实验性和自发性转移^[8]。说明趋 化因子CXCR4/CXCL12轴在乳腺癌的转移过程 中起关键的作用。MDA-MB-231表达CCL2，在 鼠的模型中形成肺转移，CCL2的中和性抗体可 以抑制转移^[9]。另外在进展期乳腺癌组织中高表 达CCL5，CCL5的表达水平与乳腺癌的进展相 关^[10]。乳腺癌细胞表达CCL2和CCL5诱导单核细 胞浸润到肿瘤组织中^[11]。肿瘤浸润的单核细胞 发育为TAMs，在CCL2、CCL5等趋化因子的作 用下分泌促肿瘤进展的因子如CCL2 、TNF-α、 MMP-9^[12]促进肿瘤复发，与预后呈负相关。总 之，肿瘤细胞表达趋化因子促进单核细胞浸润肿 瘤组织，形成一个恶性循环，持续性地浸润表达 趋化因子。趋化因子介导乳腺癌细胞和基质细胞 或免疫细胞的相互作用，影响肿瘤的进展。 趋化因子及其受体在肿瘤转移中发挥重要 作用，我们的前期研究已经证明TAMs所分泌的 标志性趋化因子CCL18对乳腺癌转移有影响， 其受体是P5TPNM3^[4]，本文在此基础上进一步研 究CCL18在乳腺癌转移过程中的作用以及作用 机制。 近期在肿瘤细胞与巨噬细胞共培养体系中 证明，肿瘤微环境可以改变巨噬细胞的表形 使其具有促进肿瘤进展的功能^[13]。本课题在已 经证明TAMs促进乳腺癌迁移的基础上，证明 TAMs通过分泌CCL18与乳腺癌细胞表面受体结 合引起细胞骨架在细胞迁移的前缘的聚集，从 而促进乳腺癌转移，为临床以CCL18为分子靶 点抑制乳腺癌迁移提供实验依据。