肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）简称 肾癌，占成人恶性肿瘤的2%～3%^[1]。肾透明细 胞癌（clear cell RCC，ccRCC）起源于肾近曲小 管上皮，是肾癌中最常见的病理类型，约占总数 的60%～70%^[1]；因此，对肾透明细胞癌的研究 也最为深入和广泛。VHL综合征可表现为家族性肾透明细胞癌。通过对VHL综合征患者进行分子 遗传学研究，发现了VHL抑癌基因。目前研究已 证实VHL基因异常在家族性和散发性肾透明细胞 癌的发病中都起着关键作用。但是有一部分患者 （30%～40%）并不存在VHL基因突变，表明有其 他机制参与肾癌的发生^[2]。研究发现Notch、PI3K/ Akt等信号通路的异常活化在肾癌的发生中也起到 重要作用^{[3, 4]}。

Notch信号通路由配体-受体结合诱导的蛋 白水解所触发，经两步剪切从细胞膜上释放活 性的Notch活性片段ICN （intracellular domain of Notch）并转入核内，调节下游靶基因的表达， 从而参与一系列细胞过程^{[5, 6]}。本课题以肾透明细胞癌的临床标本和细胞系为研究对象，运用分子 生物学和细胞生物学的方法，探讨Notch1信号过 度活化对肾癌细胞增殖的影响及其可能的分子机 制。 1 材料和方法 1.1 免疫组织化学染色法

石蜡切片60℃烘烤2 h，常规二甲苯脱蜡， 梯度酒精入水；3%新鲜双氧水避光孵育10 min 灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗涤；微波修复 抗原；滴加一抗（1:100），4℃过夜，PBS洗涤3 次，滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗， 室温孵育30 min后，PBS洗涤3次，DAB显色，苏 木精对比染色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树 胶封片。每组切片均以PBS代替一抗作为阴性对 照，以已知阳性片作阳性对照。 1.2 免疫组织化学结果判断

采用半定量的方法，根据免疫组织化学染色 强度及阳性细胞的数量分别记分。染色强度不着 色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深褐 色为3分。阳性细胞百分率＜5%为0分，5%～10% 为1分，＞10%～50%为2分，＞50%为3分。两项 指标之和0～1分为(-)，2分为(+)，3～4分为阳性 (++)，5～6分为强阳性(+++)。(-)和(+)归为低表达 组，(++)和(+++)归为高表达组，并以此为分组依 据，结合患者的临床病理参数进行统计分析。所 有组织切片由两位病理科医生进行独立盲检。当 评分结果不一致时，则请两位医生共同读片，以 达成一致。 1.3 抗体和试剂

本研究中使用的抗体包括：鼠抗人Notch1 单克隆抗体（美国Abcam公司）、兔抗人ICN1 单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公 司）、兔抗人pAkt（Ser473）单克隆抗体（美 国Cell Signaling Technology公司）、兔抗人tAkt 单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公 司）、鼠抗人PCNA单克隆抗体（美国BD公司） 和鼠抗人GAPDH单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）。pcDNA3-ICN1质粒由美国 Jon C. Aster博士惠赠。PI3K抑制剂LY-294002（美 国Sigma-Aldrich公司）溶解于有机溶剂DMSO中。 1.4 细胞培养

人肾透明细胞癌细胞系ACHN购自中科院上 海细胞库。ACHN细胞生长于含有10%胎牛血清的 DMEM 培养液中(含100 u/ml青霉素和50 μg/ml链霉素)，37℃、5%CO2饱和湿度的温箱中培养。2～3 天传代一次。细胞生长状态良好，取对数生长期 的细胞进行实验。 1.5 细胞分组及处理

将对数生长期的ACHN细胞均匀接种在6孔 板中，每孔细胞数为2.5×105，分为4组：Con组 （对照组，转染pcDNA3空载质粒）、ICN1组 （转染pcDNA3-ICN1质粒）、ICN1+LY组（转 染pcDNA3-ICN1质粒同时用25 μM的LY-294002 处理）和ICN1+DMSO组（转染pcDNA3-ICN1质 粒同时用等量DMSO处理）。将细胞置于37℃、 5%CO2培养箱中培养48 h后进行相关检查。 1.6 Western blot检测

分别提取上述4组细胞的蛋白并测浓度。取 等量蛋白，用5%的浓缩胶和10%的分离胶行SDSPAGE 电泳。电泳完成后，电转移法将蛋白质转移 到PVDF膜。5%脱脂奶粉的TBST封闭PVDF膜。 加一抗（1:1 000），4℃过夜。TBST洗涤3次。加 二抗（1:2 000），室温孵育2 h。TBST洗涤3次。 PVDF膜用ECL化学发光试剂于暗室中显影并感光 胶片。 1.7 CCK-8检测细胞增殖

将上述4组细胞每孔100 μl（含104个细胞）接 种于96孔板中。分别于接种后0、12、24和48 h， 加入10 μl的CCK-8试剂（日本Dojindo公司），在 细胞培养箱继续孵育1 h，于酶标仪上测定450 nm 波长的光吸收度并记录数据。每组细胞的每个时 间点设3个平行孔。 1.8 流式细胞术检测细胞周期

将上述4组细胞（每组2×106个细胞）制成 单细胞悬液，4%的多聚甲醛固定。每管加入含 0.2% Triton X-100和1% BSA的PBS约1 ml，冰上 静置5 min。PBS 洗涤3次。用含50 μg/ml碘化丙 啶(Propidium Iodide,PI)、0.05% Triton X-100、37 μg/ml EDTA和100 u/ml 核糖核酸酶的溶液染色30 min。BD FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期。 1.9 统计学方法

所有统计学处理均由Stata8.0统计软件完成。 分类变量的比较时，采用卡方检验；连续变量的比 较时，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 肾癌组织中Notch1的表达水平与临床病理特 征之间的相关性分析

应用免疫组织化学法检测120例肾透明细胞癌组织中Notch1的表达水平。肾癌组织的Notch1 阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞膜，可呈现完整 的胞膜形态，细胞质亦有不同程度表达，染色呈 灶状或弥漫分布，深度不一，从浅棕黄色到深褐 色，见图1。120例肾透明细胞癌组织标本中，有 64例高表达Notch1，占53.3%。Notch1的表达在不 同年龄和性别的患者中没有显著差异(P = 0.310,P = 0.242)。Notch1在直径≥7cm的肿瘤中的表达强 度要高于直径＜7cm的肿瘤(P = 0.005)。与局限期 (TNMⅠ～Ⅱ)肾癌相比，进展期(TNMⅢ～Ⅳ期)肾 癌有高表达Notch1的趋势(P=0.062)。但在不同分 级的肾癌组织中，没有发现Notch1表达强度的差 异(P=0.104)，见表1。上述结果提示，Notch1信号 通路的活化可能参与肾癌的发生发展。

图1 Notch1在肾癌组织中的低表达和高表达（免疫组织化学法，标尺，50μm） Figure 1 Representative images of low (A) and high (B)expression of Notch1 in clear cell RCC (ccRCC) tissues (IHC,Scale bars,50 μm)

表1(Table 1)

表1 Notch1表达与患者临床病理特征之间的关系(n=120) Table 1 Correlation of Notch1 expression and clinicopathological characteristics of ccRCC patients (n=120)

表1 Notch1表达与患者临床病理特征之间的关系(n=120) Table 1 Correlation of Notch1 expression and clinicopathological characteristics of ccRCC patients (n=120)

在ACHN细胞系中，通过质粒转染，过表达 外源性的Notch1活性片段ICN1持续活化Notch1 信号。Western blot检测ICN1、pAkt（磷酸化的 Akt）、tAkt（总Akt）和PCNA（细胞增殖指标） 的蛋白水平，结果提示Notch1信号过度活化后， pAkt、PCNA水平也随之上调；即Notch1信号的 活化可以上调PI3K/Akt通路的活性，进而促进肾 癌细胞的增殖，见图2。另外，在ACHN细胞中 过表达ICN1的同时，应用PI3K抑制剂LY-294002 （LY）抑制PI3K/Akt信号。Western blot的结果 表明，LY-294002可以逆转Notch1信号对pAkt和 PCNA水平的上调，见图2。因此，我们推测在 肾透明细胞癌中，过度活化Notch1信号可能通过PI3K/Akt信号通路来发挥促增殖的作用。

图2 Western blot检测各组细胞中ICN1、pAkt、tAkt、PCNA和GAPDH的蛋白水平 Figure 2 Expressions of ICN1,pAkt,tAkt,PCNA and GAPDH in ACHN cells detected by Western blot

应用CCK-8的方法检测ACHN细胞的增殖水 平，结果显示过表达外源性的ICN1活化Notch1信 号后，ACHN细胞的增殖水平明显增加；同时用 LY-294002处理，抑制PI3K/Akt信号通路，可以逆 转该现象，见图3。因此，我们认为肾癌细胞中 Notch1信号的活化可以促进肿瘤细胞的增殖；而 这一作用可能是通过上调PI3K/Akt信号通路来实 现的。

图3 CCK-8细胞增殖实验检测各组细胞的增殖水平 Figure 3 Cell proliferation of each group evaluated by using CCK-8 tests

为了进一步检测Notch1信号通路和PI3K/Akt 信号通路对细胞增殖的影响，对ACHN细胞进行 PI染色并用流式细胞术检测细胞周期的改变。结 果显示过表达外源性的ICN1活化Notch1信号后， ACHN细胞处于S期（DNA合成期）的比例明显 增多，即加快了G1～S期的细胞周期进程；而阻 断PI3K/Akt信号后可部分逆转该作用，见图 4。细 胞周期的实验结果和之前细胞增殖实验的结果一 致，也进一步验证了我们的假设，即肾癌细胞中 过度活化的Notch1信号，通过上调PI3K/Akt信号通 路的活性，加快了肿瘤细胞的增殖，进而促进肾 癌的发生、发展。

图 4 流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布 Figure 4 Cell cycle phase distribution of each group detected by fl ow cytometry

Notch信号通路是一个进化上保守的局部细 胞信号转导机制，它参与细胞的分化、增殖、凋 亡、黏附、上皮-间质转化、迁移和血管发生等 诸多细胞过程^[7]。在哺乳动物中，其受体家族包 含四个Ⅰ型跨膜受体（Notch1、Notch2、Notch3 和Notch4），可与作为表达于邻近细胞表面五种 配体分子（Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和 DLL4）特异性结合^[8]。在本研究中，我们证实 了在肾透明细胞癌中Notch1信号持续活化，并且 Notch1信号通路的过度活化可能参与了肾癌的发 生、发展。由于无限制的细胞增殖是肿瘤最显著 的特征之一^[9]，所以本研究作眼于探讨Notch1信号 通路的过度活化和肿瘤细胞增殖之间的关系。

已有研究表明，PI3K/Akt信号通路主要参与调 解细胞的增殖与存活，在多种恶性肿瘤中都处于过 度激活状态，而且过度活化的PI3K/Akt信号在这些 恶性肿瘤的发生中起着重要作用。在肾癌中，免疫 组织化学研究表明，PI3K/Akt信号通路的活化状态 与肿瘤的进展具有相关性；在进展期肾癌或者转移 性肾癌中pAkt染色往往呈强阳性^[10]。另外，不论VHL基因突变与否，在多种肾癌细胞系中，PI3K/ Akt信号均呈活化状态^[4]。

在本研究中，我们发现在肾癌中Notch1信号 的促肿瘤作用是通过上调PI3K/Akt信号来实现 的。而且，在临床肾癌标本中证实了Notch1的表 达水平与肿瘤的大小和分期之间具有相关性。我们认为PI3K/Akt信号通路位于Notch1信号的下 游，受Notch1信号的调控，但是我们并不能排除 Notch1信号与其他参与调控细胞增殖与存活的信 号通路之间的交互通话。虽然在其他肿瘤中也曾 有过报道，Notch1信号可以参与调控PI3K/Akt信号 通路，但是其调控的具体机制尚不明确^[11]。在急 性T淋巴母细胞白血病中，Notch1的活化可以抑制 PTEN的表达。作为肿瘤抑制因子，PTEN可以抑 制Akt的磷酸化，进而抑制肿瘤细胞的增殖、促进 肿瘤细胞的凋亡。因此，在急性T淋巴母细胞白血 病中，阻断Notch1信号通路可以起到很好的治疗 效果^[12]。是否在其他类型的肿瘤中也存在这种相 互作用机制，这个问题仍然需要深入研究。

最近的一项研究表明，在乳腺癌中Notch1诱 导的PI3K/Akt信号通路活化可能是通过肿瘤细胞 自分泌释放的某种生长因子来实现的^[13]。考虑 到肾癌中，血小板源生长因子（platelet -derived growth factor，PDGF-β）、血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、转 化生长因子（transforming growth factor，TGF-β） 等细胞因子都参与了肾癌的发生、发展，而 且这些生长因子都可以激活PI3K/Akt信号通 路，所以很有可能类似的相互调控机制也存 在于肾癌中。值得一提的是，研究发现在黑 色素瘤中，Notch1信号位于PI3K/Akt信号通 路的下游，受其调控^[14]。因此，进一步明确 Notch1信号通路和PI3K/Akt信号通路的相互作 用成为我们今后工作的重点。

综上所述，肾透明细胞癌中存在Notch1信号 异常活化，并且这种异常活化的Notch1信号可以 通过激活PI3K/Akt信号促进肾癌细胞增殖和G1～S 期的细胞周期进展，进而促进肾癌发生发展，该 发现提供了一种可能的肾透明细胞癌发生的新机 制和潜在分子药靶。