越来越多的证据表明肿瘤细胞中的某些亚群 具有干细胞的特性。干细胞学说认为，肿瘤干细 胞是肿瘤的发生、生长、耐药以及转移、复发的 根源。而肿瘤干细胞则是机体的正常干细胞或其 前体细胞在一系列内外因素作用下增殖分化失常 形成的。因此，肿瘤是一种干细胞疾病。目前人 们已经能够成功分离白血病、乳腺癌、脑肿瘤和 胰腺癌干细胞^{[1, 2]}。对其他一些实体瘤的研究也提 示有相应的肿瘤干细胞的存在^{[3, 4, 5]}。

要寻求攻克肿瘤干细胞的突破点，首先要探 明肿瘤干细胞的生物学行为特性和侵袭转移机 制。侧群（SP）细胞具有肿瘤干细胞的相关特 性，是目前富集肿瘤干细胞的常用方法之一。本研究采用Hoechst 33342染色与荧光激活细胞分选 （fluorescence-activated cell sorting,FACS）技术 相结合，对卵巢癌细胞系SKOV3中的SP细胞进行 检测及分选，并体外检测该细胞亚群的生物学特 性，为深入研究卵巢癌干细胞提供模型和基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 细胞

卵巢癌细胞株SKOV3为广西医科大 学附属肿瘤医院实验研究部保存。 1.1.2 主要试剂

胎牛血清、RPMI 1640培养液购 自美国Hyclone公司,7-AAD 、Hoechst 33342购自美 国Sigma公司 ，盐酸维拉帕米购自阿拉丁公司，流 式分选微球、校准微球购自美国BD公司。Matrigel 胶购自北京大学生物中心，Transwell小室购自美国 Corning Costar公司。 1.1.3 主要仪器

Influx^TM流式细胞分选仪（美国 BD公司），ZEISS倒置荧光相差显微镜，Olympus 倒置光学显微镜，Thermo CO₂培养箱。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养

人卵巢癌细胞株SKOV3，用含 10%胎牛血清、100 u/ml的青霉素和100 μg/ml链霉 素的RPMI 1640培养液、在37℃饱和湿度，5%CO₂ 恒温培养箱内培养，每3~4天传代一次。 1.2.2 SKOV3细胞中SP细胞筛选鉴定

采用 Influx^TM流式细胞仪分选法，具体方法与步骤参见 本课题组前期建立的方法^[6]。 1.2.3 细胞生物学功能体外检测

细胞生长曲线 测定采用MTT法。流式细胞仪检测细胞周期， Multicycle软件分析G₀/G₁、S、G₂/M各期细胞数 所占比例。克隆形成能力测定：采用Influx^TM流式 细胞仪，将SP细胞及non-SP细胞按照每孔200、 400、800数量分选至24孔板，培养7天后，甲醇固 定，姬姆萨染色，显微镜下计数集落。以15~50个 细胞为一个集落，用下列公式计算克隆形成率： 克隆形成率=克隆形成数/接种细胞数×100%。将3 个重复孔的结果计数后取平均值。细胞体外迁移 侵袭能力的测定：收集流式细胞仪分选出的SP细 胞和non-SP细胞，离心去上清液后，用含1%FBS 的培养液重悬细胞 ，调整细胞密度为1×10⁶/ml。 用无血清培养液将液态的Matrigel胶稀释5倍，每 个Transwell小室加入60 μl稀释后的Matrigel，置 于37℃培养箱中待其凝固后（迁移实验无需加 Matrigel，余步骤同侵袭实验），每孔上室接种 100 μl细胞悬液，下室加入500 μl含20% FBS的培 养液。置于37℃培养箱中孵育24 h后，用棉球轻轻 擦去上室内的细胞，95%乙醇固定，HE染色，200 倍显微镜下观察拍照，分别选取上下左右及中间5 个视野，计数细胞。 1.2.4 细胞自我更新能力检测

分别收集体外培养 9、14、20和30天后的SP及non-SP细胞，制备成细 胞密度为1×10⁶的单细胞悬液，用浓度为3 μg/ml的 Hoechst 33342复染，流式细胞仪分析SP及non-SP 细胞中SP细胞的比例。 1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。数值 以x±s表示，两组独立样本比较用非配对t检验， P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 SKOV3细胞系中SP细胞的检测结果

SKOV3细胞经染色后去除7-AAD染色阳性的 死细胞及细胞碎片，见图 1A，通过 Hoechst 33342 蓝光（Y轴）和红光（X轴）双参数图，见图 1B， 1C，SP细胞位于左下角两种荧光均很弱的区域。 实验组低染区SP细胞比例为（1.12±0.104）%，见 图 1B，对照组（维拉帕米阻滞组）低染区SP细胞 比例减少为0，见图 1C，全被维拉帕米阻滞，证实 卵巢癌细胞株SKOV3中确实存在SP细胞。

A:Viable cells (91.5%); B: Hoechst 33342 group; C: Hoechst 33342+Verapamil group; FSC: fluorescence-activated cell; SP: side population; non- SP: non-side population 图 1 Flowjo软件分析卵巢癌细胞株SKOV3中侧群细胞比例 Figure 1 Side population(SP) cells proportion in SKOV3 cell line analyzed by Flowjo software

图选项

用MTT比色法连续7天测定SP与non-SP细胞的 吸光度（OD）值，发现第1至第3天，细胞生长缓 慢，SP和non-SP细胞均处于潜伏期，自第4天起， 细胞生长速率增快，至第六天时SP与non-SP细胞 的生长速度开始出现明显差异（P＜0.05），表明 SP细胞较non-SP细胞有更强的增殖能力，见表 1。

表 1 SP细胞与non-SP细胞体外增殖能力比较（x±s,n=3） Table 1 Comparison of the proliferation between SP cells and non-SP cells in vitro (x±s,n=3)

表选项

接种细胞数目为800、400、200个时，SP细胞 的克隆形成率分别为（12±1.5）%、（10±2.3）% 及（8.9±1.1）%，non-SP细胞的克隆形成率则分别为（3.0±0.8）%、（1.75±0.5）%及（1.7± 0.2）%。不同细胞接种组的SP和non-SP细胞的克 隆形成率差异均有统计学意义（P＜0.05），说明 SP细胞的克隆形成能力强于non-SP细胞。 2.4 SP细胞与non-SP细胞迁移、侵袭能力比较

SP细胞、non-SP细胞接种于Transwell小室24 h 后，固定染色并计数。non-SP细胞迁移数为（74± 4）个，SP细胞迁移数为（91±6）个，差异有统计 学意义（P=0.024）。non-SP细胞侵袭数为（34± 4）个，SP细胞侵袭数为（60±5）个，差异有统计 学意义（P=0.000），见图 2。

A: non-SP cells migration; B: SP cells migration; C: non-SP cells invasion; D: SP cells invasion 图 2 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力（×200） Figure 2 Cell migration and invasion detected by Transwell(×200)

图选项

流式细胞仪检测SP与non-SP细胞周期结果 显示：SP细胞在G₀/G₁、S、G₂/M各期的分布比 例分别为（69.94±5.39）%、（26.98±3.98）%及 （2.78±2.57）%、non-SP细胞则分别为（45.34± 4.62）%，（33.53±5.69）%及（18.12±6.54）%。 SP与non-SP细胞在G0/G1期（P=0.004）及G2/M期（P=0.019）的分布比例有显著差异，结果表明SP 细胞大多数处于细胞周期的静止期，见图 3。

图 3 流式细胞仪检测non-SP（A）与SP（B）的细胞周期 Figure 3 Cell cycle of non-SP cells (A) and SP cells (B) detected by flow cytometry

图选项

流式细胞仪分选出的SP细胞及non-SP细胞 体外培养9、14、20和30天后，Hoechst 33342重 新染色后上流式细胞仪分析SP细胞比例。SP细 胞组的SP比例分别为（6.65±0.36）%、（2.5± 0.18）%、（1.2±0.21）%及（1.1±0.18）%，non- SP细胞组的SP比例分别为（0.012±0.003）%、 （0.018±0.014）%、（0.026±0.005）%及（0.014 ±0.01）%。结果表明：SP细胞可分化为non-SP细 胞，SP比例随着培养时间的增加而逐渐减少，培 养20天后其SP比例稳定在1%左右，与亲本SKOV3 细胞株中SP细胞比例一致。而non-SP不可分化为 SP细胞，见图 4。

图 4 SP细胞（A）及non-SP细胞（B）体外培养7天后SP 比例示意图 Figure 4 SP proportion in SP cells (A) and non-SP cells (B) cultured in vitro after 7 days

图选项

卵巢癌致死率为各类妇科肿瘤之首。传统的 手术、化疗、放疗均未能有效提高患者的5年生存 率，因此探索治疗卵巢癌的新方法具有极其重要 的意义。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSC）理 论的提出使得我们重新审视传统的研究思路及方 法。若能将治疗策略靶向卵巢癌CSC，则有望提 高疗效，降低患者死亡率。由于卵巢癌CSC缺乏特异性的表面标志物，而SP表型可用于分选表面 标志物不明确的肿瘤干细胞，因此SP细胞为研究 卵巢癌干细胞提供了一种实用而简便的手段。目 前在鼻咽癌^[7]、肝癌^[8]、甲状腺癌^[9]等多种肿瘤组 织和细胞系中均检测不同比例的SP细胞，并证实 SP细胞具有CSC特性。

本课题组在前期研究^[6]中，已证实人卵巢癌 细胞株SKOV3中存在少量的SP细胞亚群，并分析 了不同终浓度的Hoechst 33342以及不同SKOV3细 胞密度对SP细胞比例的影响，优化了SKOV3中SP 细胞分选的实验条件，为分选其他肿瘤组织或细 胞株中的SP细胞建立了参照标准。利用SP表型分 选出来的卵巢癌细胞是否具有肿瘤干细胞的特性 则是本次研究中需解决的关键问题。本研究通过 比较SP细胞与non-SP在体外的增殖速度、克隆形 成能力、侵袭与迁移能力、自我更新能力及在细 胞周期各时相的分布情况来验证SP细胞是否具备 肿瘤干细胞特征。结果表明：SP细胞在体外具有 高增殖活性，较强的克隆形成能力及侵袭迁移能 力。进一步研究发现，SP细胞大多数（70%左右） 处于细胞周期的G0/G1期即静止期，在细胞周期中 相对静止是正常干细胞的一个重要特征^[10]（该结 果表明SP细胞与正常干细胞在细胞周期方面具有 相似性，是SP细胞具备干细胞特性的实验依据之 一）。分选出的SP细胞培养9天左右，检测其SP 比例为6.65%，培养14天SP比例下降至2.5%，培 养超过20天其SP比例与亲本SKOV3细胞株中SP细 胞比例趋于一致，而non-SP不可分化为SP细胞， 该结果提示SP细胞能自我更新并且分化，具有同 正常干细胞类似的特征。Kondo等^[11]从神经胶质瘤 细胞系C6中分离出SP细胞和non-SP细胞，继续培 养一段时间后发现，SP细胞能产生SP和non-SP细 胞，而non-SP细胞则不具备此种特性。以上研究 表明SP细胞一方面通过自我更新来维持自身比例 的恒定性，另一方面通过分化形成大量的non-SP 细胞。SP细胞在体外长期培养后，重新形成由少 数强致瘤性SP细胞和多数弱致瘤性non-SP细胞所 构成的异质性细胞群体。

利用SP细胞表型特点与流式分选技术，是富 集CSC的一种有效手段。相对于其他方法，如悬 浮球培养，特异性分子标记等，SP细胞分选更为 简便有效。本研究结果显示卵巢癌细胞株SKOV3 中存在少量SP细胞，这个细胞亚群具备干细胞所 特有的自我更新及分化潜能，相对于non-SP细胞 及亲本细胞，SP细胞侵袭转移能力强，恶性程度 高，具有肿瘤干细胞的生物学特性。SKOV3中SP 细胞为卵巢癌干细胞研究提供了一个新的平台。