Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与溃疡性结肠炎的癌变密切相关，β-catenin在胞质中大量积聚并被转运至细胞核中，激活下游靶基因，导致细胞的不典型增生和癌变^[1]。DKK-1是一种分泌蛋白，它与LRP及另一类穿膜蛋白Kremen结合，形成三聚体后诱导快速的细胞内吞作用，减少细胞膜上的LRP，从而阻断Wnt信号向细胞内传递^[2]。我们在前期研究中观察到香连片可以有效预防小鼠溃疡性结肠炎癌变^[3]，本实验通过观察香连片对小鼠溃疡性结肠炎癌变过程中DKK-1 mRNA、β-catenin和PCNA蛋白表达的影响，探讨香连片对小鼠溃疡性结肠炎癌变过程中Wnt/β-catenin信号通路的作用，进一步明确香连片预防小鼠溃疡性结肠炎癌变的作用机制。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 动物

清洁级BALB/C雄性小鼠，体质量（20±2）g，由上海中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号scxk（沪）2007-005。1.1.2 中药、试剂及仪器

香连片由黄连（吴芙萸制）和木香组成，每片0.3 g，湖北香连药业有限公司生产，柳氮磺胺嘧啶，每片0.25 g，上海中西三维药业有限公司产品，上述药物溶解在蒸馏水中，香莲片用药浓度为13.5 mg/ml，该浓度是通过前期动物实验确定的有效剂量^[3]，柳氮磺胺嘧啶的用药浓度为7.5 mg/ml，（每只小鼠按0.1 ml/20 g灌胃），各用药组小鼠造模前1周开始用药到造膜的第10周，用药时间共计11周。1，2-二甲肼（dimethylhydrazine,DMH），葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate ,DSS），分子量36~50 kDa，购自Sigma公司；兔抗鼠β-catenin一抗、PCNA一抗，购自Abcam生物工程有限公司；SABC免疫组织化学试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；ELx800NB 酶标仪，美国BioTek公司；ABI Step1荧光定量PCR仪，美国ABI公司；Trizol购自上海生工生物工程有限公司；反转录试剂盒和荧光定量试剂盒，购自大连宝生物工程有限公司；DKK-1引物，由上海生工生物工程有限公司合成。 1.2 实验分组及动物模型

48只BALB/C小鼠随机分为空白组、模型组、香连片用药组、柳氮磺胺嘧啶阳性对照组，每组12只小鼠。参照文献^[4]，采用DMH腹腔注射结合自由饮用葡聚糖硫酸钠DSS法，加以改良，制备溃疡性结肠炎癌变模型：雄性5周龄BALB/C小鼠,腹腔注射DMH 20 mg/kg（浓度为4 mg/ml，每只小鼠按0.1 ml/20 g注射），每周2次，继而各造模组小鼠的饮用水中添加5%DSS 2周，以上述过程（3周）为1个循环，重复3个循环，第10周后不做任何处理，造模持续时间为18周。 1.3 Real-time PCR检测DKK-1基因的表达

取新鲜正常肠组织和病变肠组织80 mg左右按总RNA提取试剂盒的操作说明分别提取RNA（各组提取3个不同小鼠肠组织的RNA），Biotek酶标仪检测各组提取的RNA浓度，终浓度稀释至1.8~2.6 μl，按反转录试剂盒说明以10 μl体系反转录成CDNA，荧光定量PCR扩增，每个反应体系为25 μl，每组设3个复孔，DKK-1引物序列：上游序列5'-GACTCTTGACAACTACCAGC-3'，下游序列5'-AAATGGCTGTGGTCAGAGGG-3'，ABI step one PCR仪反应程序为,95℃变性30s、60℃退火30s、40个循环。以β-actin作为内参照。 1.4 SABC免疫组织化学检测β-catenin和PCNA蛋白的表达

各组组织病理切片常规脱蜡至水，微波炉95℃~100℃加热修复抗原；3% H₂O₂-甲醇封闭内源性过氧化物酶,室温20 min；5%牛血清白蛋白溶液封闭30 min；滴加β-catenin和PCNA一抗（兔抗，稀释度分别为1 ：500和1 ：250），4℃摇床过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗,37℃孵育30 min；DAB液显色；轻度核复染、脱水、透明、封片。以上需洗涤的步骤均用PBS洗3次，每次3 min。 1.5 结果判定

β-catenin以细胞膜、细胞质或细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，PCNA以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。结果判定标准：采用二级计分法计数阳性细胞，高倍镜下随机选择5个视野（400倍），计数100个细胞，根据阳性细胞比例及阳性细胞着色强度计分：阳性细胞数<5%、5%~25%、>25%~50%、>50%分别判定为0、1、2、3分；阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别判定为0、1、2、3分。根据两项积分之积判定结果，0分为阴性（-），1~2分为弱阳性（+），3~5分为中等阳性（++），6~7分为强阳性（+++）。1.6 统计学方法

所有数据均采用SPSS18.0统计软件进行分析，各组计量数值采用x±s表示，RT-PCR结果采用秩和检验、免疫组织化学结果采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 香连片对β-catenin、PCNA蛋白表达的影响

香连片用药组β- caten in表达较模型组阳性率明显降低，差异具有统计学意义（F=4.16，P=0.038），与空白组和柳氮磺胺嘧啶组之间差异无统计学意义（P>0.05），同样，香连丸用药组PCNA蛋白表达阳性率较模型组明显减低（F=8.537，P=0.001），见表 1、图 1~2。

表 1 各组小鼠β-catenin和PCNA蛋白表达 Table 1 Expression of β-catenin and PCNA protein in each group

表选项

图 1 各组小鼠β-catenin蛋白表达 Figure 1 Expression of β -catenin protein in each group

图选项

图 2 各组小鼠PCNA蛋白表达 Figure 2 Expression of PCNA protein in each group

图选项

采用∆∆CT法分析目的基因的相对表达量，样本的相对表达量=2^－∆∆CT。∆∆CT=观察样本∆CT−对照样本∆CT=（观察样本目的基因CT−观察样本内参基因CT）−（对照样本目的基因CT−对照样本内参基因CT）。每个样本CT值和三个复孔均值CT由ABIPCR仪自动生成。香连片组DKK-1 mRNA的值为（2.788±1.01），与模型组的值（0.927±0.254）相比，差异具有统计学意义（F=6.12，P=0.047），与柳氮磺胺嘧啶组的值（2.918±1.211）相比，差异无统计学意义（P>0.05），见图 3。

*: P<0.05, compared with model group 图 3 各组小鼠DKK-1mRNA表达 Figure 3 Expression of DKK-1mRNA in each group

图选项

β-catenin是Wnt信号通路的关键蛋白，Claessen等^[5]通过免疫组织化学发现在炎性肠病不典型增生区和癌变区肠道组织的β-catenin表达分别为50%和100%。增殖细胞核抗原PCNA在增殖细胞的G1后期和S期表达明显，PCNA免疫组织化学指标是判断结肠黏膜上皮增殖活性的一个可靠指标^[6,7]。本实验免疫组织化学结果提示香连片用药组小鼠β-catenin表达较模型组明显下降（P<0.05），说明香连片用药可以通过下调β-catenin的蛋白表达抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制肠上皮的不典型增生，这与PCNA蛋白检测结果一致，香连片用药组PCNA蛋白表达较模型组明显下调（P<0.01）。柳氮磺胺嘧啶是目前临床预防溃疡性结肠炎常用药，文献报道柳氮磺胺嘧啶可以降低β-catenin的表达^[8]，故本实验选择该药作为阳性对照，本实验香连片用药组和柳氮磺胺嘧啶组之间未见明显差异（P>0.05）。

文献报道DKK-1在人类不同肿瘤中的表达和作用不尽相同，在结肠癌的发生中DKK-1的表达减少或缺失可以激活Wnt信号通路，引起细胞过度增殖^[9]，但另一方面，DKK-1在有的肿瘤中却过度表达，如DKK-1在肝癌中却异常高表达并促进肝癌的浸润和转移^[10]。本实验Real-time PCR检测结果表明香连片可以上调DKK-1表达，与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05），从而一定程度抑制Wnt信号通路，下调β-catenin蛋白表达，抑制溃疡性结肠炎癌变。

综合以上实验结果，初步可以认为香连片预防小鼠溃疡性结肠炎癌变作用机制与上调DKK-1的表达，阻抑Wnt/β-catenin信号通路有一定关系。