益气除痰方由党参、法夏、白术、云苓、栝 蒌皮、鱼腥草、露蜂房、枳实等组成。君药为党 参、半夏益气健脾化痰；臣药白术、云苓健脾化 痰，鱼腥草清热化痰，露蜂房消积化痰；佐药枳 实破气行痰消积；使药栝蒌皮化痰理气宽胸；各 药作用共发挥益气健脾、宣肺化痰等功效。在前 期临床研究^[1]中已发现该方加减用于中晚期老年非 小细胞肺癌患者可显著延长中位生存期至13月， 具有一定的临床疗效。本文采用血清药理学方法 进一步研究其抗肿瘤作用机制。

SPF级SD大鼠30只，150~180 g， 雌雄各半，动物质量合格证号：0045100，许可证 号：SCXK（粤）2006～0015，由南方医科大学实 验动物中心提供；饲养于广州中医药大学第一附 属医院实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK （粤）2008-0092。

中药材购自广州中医药大学第 一附属医院门诊部；RPMI1640培养液购自Gibco公 司；MTT [溴化-3(4，5-二甲基-2-噻唑基-2，5-二苯 基四氮唑丁)] （以三蒸水配制成5 mg／ml浓度）、 二甲基亚枫(DMSO)和PI染液购自Sigma公司； 顺铂注射液购自南京制药厂有限公司（批号： 20071105）。

人肺腺癌A549细胞株由南方医科 大学惠赠。将肺腺癌A549细胞接种于含10％灭活 新生小牛血清的RPMI1640培养液中，置培养箱于 5％CO2、37℃、100%湿度条件下培养传代，取对 数生长期细胞进行实验。

按益气除痰方组 成准确称取各药材，以纯净水浸泡中药高出药面 约3 cm，浸泡约30 min，按常规煎煮三次^[2]，将所 有的药液混合后于文火煎煮，浓缩制成每毫升含 有1.5 g生药材的汤剂。分装后4℃保存。

（1）灌胃量 计算: 根据粗略估算法^[3]，给予益气除痰方药量＝ 70×0.018×5×10g/(kg·d)=63g/(kg·d)（相当于成 人用药剂量的10倍），灌胃量＝42 ml/(kg·d)。 （2）分组及给药: 大鼠标号、称重、随机分两组： 益气除痰方药物组和阴性对照组。益气除痰方药物 组灌胃益气除痰方汤剂，阴性对照组灌胃0.9%氯化 钠溶液。每天剂量分两次灌胃，间隔约8 h，连续 灌胃5天^[4]，第4天晚上开始禁食不禁水，于末次灌 胃后1 h取血；3%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血。 （3）血清制备: 将血液置于消过毒的离心管中，做 好标记。室温下静置2~3 h后以3 000 r/min离心10~15 min，分离血清，将同组血清混合；56℃灭活30 min；过滤灭菌；分装后于-20℃冰箱保存备用。

（1）接 种、培养细胞 取对数生长期细胞制备成单个细 胞悬液，以每孔1 000个细胞接种于96孔培养板， 分10组，每组设四个复孔，每孔体积200 μl；共 3块96孔培养板。放入37℃、5%CO2培养箱中培 养，24 h观察A549细胞贴壁后，吸掉培养液，分 别加入空白对照组（35%新牛血清）、阴性对照 组（35%大鼠未加药物处理血清）、5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%（益气除痰方含药 血清）、3 μg/ml DDP(阳性对照组)，各组分别设 四个复孔，继续培养。（2）呈色、比色 分别培 养24、48、72 h后，吸掉培养液，各孔加入无血 清RPMI1640培养液40 μl+MTT溶液10 μl，37℃孵 育3 h，终止培养，弃孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min。选择490 nm波长，酶联免 疫检测仪测定各孔光吸收值，记录结果。并按照 下列公式计算细胞活性（%）：细胞活性=T/D× 100%（T：各测定孔细胞的光吸收值；D：对照孔 细胞的平均光吸收值）

收集经过阴性血清、10% （低剂量）、20%（中剂量）、30%（高剂量）含 药血清及阳性对照处理的细胞，提取DNA（试剂 盒），定量后制备胶板，将琼脂糖溶液倒入电泳 支架上，放上梳子，梳子离开电泳支架底部1 mm 左右。待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放 入装有电极缓冲液（1×TBE Buffer）的电泳槽中， 各孔加2 μl溴酚蓝和7 μl DNA样品，点样端朝负 极，通电，电压为80 V。至溴酚蓝移到距边3 cm 处停止电泳，取出凝胶，紫外灯下检测。

设 置含药血清培养浓度，经过阴性血清、10%（低 剂量）、20%（中剂量）、30%（高剂量）含药血 清及阳性对照处理后，收集细胞，计数，调整细 胞浓度为每毫升1×106。取1 ml细胞，1 000 r/min， 4℃离心5 min，弃上清液。PBS清洗两次后，70% 乙醇固定过夜。1周之内检测，检测前4℃条件下 PBS清洗，加入PI染液1 ml，避光30 min。流式 细胞仪上机检测，记录激发波长488 nm处红色 荧光，细胞凋亡时，G1期前出现亚二倍体峰（凋 亡峰）。

倒置显微镜下观察空白组、阴性组、不同含 药血清组及阳性组各孔细胞生长及形态变化。24 h 除阳性组外，其余各组细胞形态变化不明显，经 顺铂处理的阳性组细胞缩小、包膜完整；48、72 h 时观察25%、30%、35%含药血清组细胞形态发生变化，细胞呈空泡状改变，且随着浓度的增高， 状态更差，但是细胞在数量上是增多的，阳性组 细胞缩小的数量增加，总体数量增多不明显。益 气除痰方含药血清及阳性组对A549细胞活性的影 响，以其空白组细胞活性为参考标准，实验结果 显示：含药血清对A549细胞活性具有抑制作用， 且时间和血清浓度对细胞的生长有显著的影响 （Univariate分析P均小于0.01），见表 1，并最终 确定10%、20%、30%含药血清为实验浓度。

表 1 益气除痰方含药血清对A549细胞体外生长的抑制作 用 (x±s) Table 1 Inhibition of medicated serum of Yiqi Chutan Decoction on the growth of A549 cells in vitro(x±s)

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0: Negative; 1: Low dose; 2: Medium dose; 3: High dose; 4:Positive; 5: DNA marker 图 1 A549细胞DNA琼脂糖凝胶电泳图 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of A549 cell DNA

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表 2 益气除痰方含药血清对A549细胞凋亡率的影响(x±s) Table 2 Effect of medicated serum of Yiqi Chutan Decoction on apoptosis of A549 cells (x±s)

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A: blank group (1.23±0.42)%; B: negative group(1.30±0.30)%; C: low dose group(8.40±1.67)%; D:medium dose group(15.80±2.95)%; E: high dose group(27.4±0.96)%; F: positive group(39.00±1.11)% 图 2 流式细胞仪检测A548细胞凋亡 Figure 2 Apoptosis of A548 cells detected by flow cytometry

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肺癌为有形之块，中医以“积”“癥”名之。肺 癌是在机体气血阴阳等物质匮乏的基础上，或因 禀赋、或因六淫、或因饮食、或因邪毒，导致脏 腑经络功能失调，肺失宣降，气机不利，血行瘀 滞，津液不布，生成瘀血痰浊等病理产物，通过 邪正斗争的矛盾运动，邪胜正衰而成，是一种全 身属虚，局部属实的疾病。中晚期肺癌证型具有 多样性和复杂性，一系列对中晚期肺癌证型的调 查研究显示：在各证型中以气虚为主的兼挟证最 多^[1]，气虚、脾虚痰湿证常见证型之一^{[5, 6, 7]}。《难 经》说:“损其肺者，益其气……”。周岱翰教 授、林丽珠教授在长期的临床实践中确立益气除 痰法为中晚期肺癌的治疗大法，并进行了相关 临床研究^[1]，结果提示益气化痰法可使Ⅲ、Ⅳ期 NSCLC的中位生存期达到9月，与化疗配合应用 可达到12月，是晚期非小细胞肺癌的一种有效疗 法。其中，脾虚痰湿型患者中位生存期达到13 月，有可能进一步提高疗效。并有研究^{[8, 9, 10]}提示其 可以改善中晚期非小细胞肺癌患者的生存质量， 减轻化疗的不良反应。

“药物血清”的概念最早于80年代由日本昭和药 科大学田代真一教授提出^[11]。所谓“药物血清”，是 指给动物或人服用一定量的药物后。经过一定的 时间采血所获得的血清，以模拟并试图替代药物 本身而供实验研究使用的一种非单体药物药理研 究的方法。近20余年，该方法在中药基础研究中 发挥着重要的作用。但目前，该方法在国内还没有 统一的规范方法，其中很多细节问题需要解决。

在本实验中，根据相关文献报道^{[4, 12]}，选用大 鼠作为含药血清的供体，并以整体模型动物的有 效剂量（为临床成人剂量的10倍量）给药，并连续 给药5天，使药物达到稳定的血药浓度。取血后置于56℃灭活血清，去除血清中存在的补体，减少对 实验的影响。但血清成分复杂，不可控的影响因素 很多，血清本身固有的活性成分常影响实验结果， 缺乏除去影响因素的理想措施^[13]。故本实验设计空 白对照组（新生牛血清）与阴性对照组（大鼠空白 血清），以排除大鼠血清自身因素引起的干扰。

MTT比色实验中^[14]，在一定细胞数范围内， MTT结晶形成的量（光吸收值）与细胞数成正 比。利用此原理测定空白组、阴性组及不同浓度 含药血清处理组在适宜条件下培养后光吸收值变 化，以空白组光吸收值为基准，算出各组相对 量，以此来表示各实验组的细胞活性，据此建立 MTT法用于检测药物对细胞增殖的抑制作用。通 过本实验数据分析发现，益气除痰方含药血清对 肺腺癌A549细胞增殖具有抑制作用，具有明显的 剂量依赖性，高剂量组效果相对较好，但是，血 清浓度过高本身对细胞生长具有影响，35%含药 血清组对细胞生长的影响不稳定，故最终确定了 10%、20%、30%为实验浓度。琼脂糖凝胶电泳试 验可对分离的DNA进行检测，该研究中琼脂糖凝 胶电泳提示高剂量组及阳性组均可见明显的DNA Ladder条带，而阴性组及低、中剂量组均未见明显 条带，说明益气除痰方含药血清达到一定浓度后 可诱导A549细胞凋亡，而中、低剂量组未见凋亡 条带，可能因含药血清浓度低，无法诱导凋亡， 或者细胞凋亡数量较少有关。细胞凋亡在机体的 胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着 十分重要的作用。Propidium iodide（PI）是一种核 酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中 晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细 胞核红染。PI单染法中，测定不同处理的实验组 的细胞凋亡率经单因素方差分析统计后，差异有 统计学意义（P<0.05）；不同浓度含药血清组之 间凋亡率比较差异有统计学意义（P<0.05），表 现为明显的剂量依赖关系；但各组与阳性组比较 差异有统计学意义（P<0.05）。

实验以顺铂为阳性对照组，其诱导凋亡作用 较中药组明显，考虑与体外实验与体内实验具有 差异、含药血清中药物浓度难以确定、化疗药物 直接作用比较强等因素相关。

综上所述，本实验研究采用含药血清体外培 养的方法证实了益气除痰方对A549细胞具有明显 的抑制增殖和诱导凋亡的作用，但其作用机制尚 需进一步的研究。