研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ， PPAR-γ)的合成配体噻唑烷二酮类药物具有抑制肿 瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用^[1]，此类 作用与多种细胞内信号通路有关，但具体机制尚 不清楚^[2]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases,MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏 氨酸蛋白激酶，是将细胞外刺激信号传递到细胞 核，介导细胞产生反应的重要信号通路，在细胞 的增殖、分化及凋亡等进程中发挥关键性作用^[3]， 尤其是对肿瘤细胞的凋亡诱导作用更是目前研究 的热点。噻唑烷二酮类药物是否可以通过MAPKs 通路影响肝癌细胞的增殖及凋亡，目前尚未见报 道。本实验通过观察噻唑烷二酮类经典药物罗格 列酮对体外培养的人肝癌HepG2细胞增殖与凋亡 的影响，研究MAPKs通路相关蛋白的表达变化， 探讨其作用机制。

人肝癌细胞系HepG2由河北医科大学第四医 院科研中心提供。罗格列酮购自北京上草生物 科技有限公司，溶于二甲基亚砜(DMSO)后过滤 除菌，-20℃保存。β-actin和p-p53鼠抗人单克隆 抗体、Bcl-2和Bax兔抗人单克隆抗体均购自美国 Santa Cruz Biotechnology公司，兔抗人ERK1/2、 p-ERK1/2多克隆抗体及p38MAPK、p-p38MAPK 单克隆抗体均购自美国Ce l l Signa l ing公司。 p38MAPK通路抑制剂SB203580购自美国Sigma公 司。细胞蛋白提取试剂盒、Bradford法蛋白定量试 剂盒及DAB检测试剂盒购自上海索莱宝生物科技 有限公司。JEM-1200EXⅡ透射电子显微镜为日本 电子JEOL公司产品。

人肝癌HepG2细胞置于5%CO₂、37℃恒温培养 箱中，培养液为含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉 素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640。每2~3天传代 一次，取对数生长期的细胞进行实验。

将HepG2细胞按1×10⁴个/孔接种于96孔板， 孵育24 h后加入以DMSO溶解的罗格列酮(终浓度 分别为0、1、10、100、200 μmol/L)，每组设6个 复孔，设阴性对照(只加等量DMSO)及空白组(只 加培养液)。培养12、24、36 h后，每孔加入20 μl MTT，孵育4 h，弃上清液，加入100 μl DMSO， 振荡10 min至结晶充分溶解，于酶标仪490 nm波 长处测定吸光度 (A)值。细胞增殖抑制率=(对照 组A值－试验组A值)/(对照组A值－空白组A值)× 100%。实验重复 3 次。

取HepG2细胞(5×10⁵个/培养瓶)，经罗格列 酮(终浓度为0、1、10、100 μmol/L)、10 μmol/L SB203580及100 μmol/L罗格列酮+10 μmol/L SB203580分别作用24 h后收获细胞。经70%冰乙醇 固定12 h后离心弃固定液，PBS重悬5 min后500目 筛网过滤成单细胞悬液，加入DNA染色液4℃避光 30 min后上机检测。在二倍体细胞峰前出现一个亚 二倍体峰判定为凋亡细胞峰，以凋亡率表示凋亡 状态。实验重复3次。

取HepG2细胞(5×10⁵个/培养瓶)，经罗格列酮 作用24 h后收获细胞，PBS漂洗，1 200 r/min离心 10 min，细胞团经4%戊二醛前固定2 h,1%锇酸后 固定1 h,常规酒精梯度脱水,醋酸铀染色,树脂包 埋,超薄切片,经柠檬酸铅染色后封片,透射电子显 微镜观察照相。

按照方法1.2.3进行细胞培养和分组，收获细 胞，按照试剂盒说明提取细胞总蛋白并检测蛋白 浓度。 取50 μg样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电 转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，分别 加入1:200稀释的β-actin和p-p53抗体、1:500稀释的 ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK抗 体、1:150稀释的Bcl-2和Bax抗体，4℃过夜；加入 相应二抗，37℃孵育2 h，DAB显色，β-actin为内 参照。将目标条带与β-actin条带的吸光度值之比作 为其蛋白表达水平的参数。实验重复3次。

实验数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。计 量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数比较 采用方差分析，其中两两比较用S-N-K检验。两组 均数比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

MTT 结果显示，罗格列酮能够明显抑制 HepG2细胞的增殖，且具有时间及浓度依赖性， 见图 1。1 μmol/L罗格列酮作用24 h后，HepG2细胞 的抑制率为(12.44±1.16)%，较12 h组有显著提高(P ＜0.05)，而200 μmol/L罗格列酮作用24 h后抑制率 可达到(53.84±3.72)% 较200 μmol/L罗格列酮作用 12 h组及100 μmol/L罗格列酮作用24 h组均有显著 提高(P＜0.05) ，见表 1。

ROZ:rosiglitazone 图 1 罗格列酮对HepG2细胞的增殖抑制作用 Figure 1 Inhibitory effect of Rosiglitazone on proliferation of HepG2 cells detected by MTT

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表 1 罗格列酮对HepG2细胞的增殖抑制作用 (n=6,x±s) Table 1 Inhibitory effects of Rosiglitazone(ROZ) on proliferation of HepG2 cells detected by MTT (n=6,x±s)

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流式细胞术结果显示，罗格列酮可诱导HepG2细胞凋亡。1 μmol/L罗格列酮作用24 h后，HepG2 细胞凋亡率为(8.87±0.54)% (P＜0.05)，随着药物浓 度增加凋亡率逐渐升高。100 μmol/L罗格列酮作用 24 h后凋亡率为(23.62±1.41)%，联合应用10μmol/L SB203580后凋亡率降至(12.15±0.72)%两者差异 具有统计学意义(P＜0.05)。SB203580单独作用对 HepG2细胞的凋亡无明显影响(P＜0.05)，见表 2。

表 2 罗格列酮及其联合SB203580对HepG2细胞凋亡的影 响(n=3,x±s) Table 2 Effect of Rosiglitazone combined with SB203580 on apoptosis of HepG2 cells treated for 24h (FCM) (n=3,x±s)

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罗格列酮作用后，电子显微镜下可见典型的 HepG2细胞凋亡表现: 细胞体积缩小,常染色质增 加,核质比例减少。部分细胞染色质凝集、固缩、 边缘化，聚集于核膜下呈境界分明的团块状、花 瓣状或新月体形，线粒体肿胀甚至空泡化，有的 可见核碎裂及凋亡小体形成，见图 2。

A:×4000; B:×12000 图 2 电子显微镜观察罗格列酮诱导的HepG2细胞凋亡 Figure 2 Rosiglitazone-induced apoptosis of HepG cells observed by transmission electron microscope

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Western blot结果显示：随着罗格列酮浓度的 增加，HepG2细胞中p-p38MAPK蛋白的表达水平 显著升高，但p38MAPK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白 均无明显变化；同时p-p53和Bax蛋白表达水平显 著升高，而Bcl-2蛋白表达水平显著降低，见图 3。 SB203580单独作用对HepG2细胞中p-p53、Bcl-2和 Bax蛋白的表达无明显影响，但与罗格列酮联用后 可明显削弱罗格列酮引发的p-p53、Bcl-2和Bax蛋 白表达变化(P＜0.05) ，见图 4。

*:P<0.05,compared with 0 μmol/L ROZ; ▲: P<0.05,compared with 0, 1 μmol/L ROZ; ●: P<0.05,compared with 0,1,10μmol/L ROZ 图 3 罗格列酮对HepG2细胞ERK1/2、p-ERK1/2、 p38MAPK、p-p38MAPK、p-p53、Bcl-2和Bax蛋白表达的 影响 Figure 3 Effect of Rosiglitazone on the expression of ERK1/2,p-ERK1/2,p38MAPK,p-p38MAPK,p-p53,Bcl-2 and Bax protein in HepG2 cells at various concentrations for 24h

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*: P<0.05; SB: SB203580 图 4 罗格列酮联合SB203580对HepG2细胞p-p53、Bcl-2和 Bax蛋白表达的影响 Figure 4 Effect of Rosiglitazone(100μmol/L) combined with SB203580(10μmol/L) on expression of p-p53,Bcl-2 and Bax protein in HepG2 cells for 24h

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罗格列酮是噻唑烷二酮类药物的典型代表， 临床上广泛使用于治疗Ⅱ型糖尿病。近期研究表 明，罗格列酮具有一定的抑癌作用。Shen等^[4]在 体内外实验中均发现罗格列酮可抑制人肝癌MHCC97L 、BEL-7404细胞的侵袭和转移；我们之前的 研究也发现罗格列酮可通过调控PTEN及VEGF蛋 白的表达抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖^[5]。 我们通过流式细胞检测及电镜形态学观察证实， 罗格列酮可显著抑制HepG2细胞的增殖并诱导其 凋亡。

目前发现MAPKs家族中存在着多条并行的信 号通路，不同的细胞外刺激可激活不同的MAPKs 通路，其中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38MAPK)通路与细胞外信 号调节激酶1/2(extra cellular signal-regulated protein kinase,ERK1/2)通路是研究的重点^[6]。MAPKs各通路的具体功能仍有差异，ERK1/2通路主要传递细 胞丝裂原信号，参与调节细胞周期及促进细胞增 殖分化，p38MAPK通路则在炎症与细胞凋亡等应 激反应中发挥重要作用^[7]。Fujita等^[8]研究发现，曲 格列酮(噻唑烷二酮类药物)可通过激活p38MAPK 通路在体外诱导肾癌细胞的凋亡。Liu等^[9]的实验 显示，高浓度环格列酮可诱导白血病HL-60细胞 的凋亡，并认为这与p38MAPK通路及caspase-3 的激活有关。本实验发现，经罗格列酮作用后， HepG2细胞p-p38MAPK蛋白的表达水平显著提 高，而p38MAPK蛋白、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白 未见明显变化；且p38MAPK通路特异性抑制剂 SB203580可显著降低罗格列酮诱导的HepG2细胞 的凋亡率，说明罗格列酮是通过激活p38MAPK通 路而非ERK1/2通路诱导HepG2细胞凋亡的。

p38MAPK通路对肿瘤细胞的凋亡诱导作用主 要是通过调控下游凋亡基因的表达实现的。p53基 因是重要的抑癌基因，其活性调节主要发生在转 录后水平，即p53蛋白的磷酸化激活，磷酸化p53 蛋白通过调控细胞周期及诱导细胞凋亡发挥抑癌 作用^[10]。Bcl-2蛋白家族在诱导凋亡的线粒体信号 途径中起着重要的作用，抗凋亡的Bcl-2和促凋亡 的Bax是其重要成员。Bax/Bcl-2的比值与肿瘤细 胞的凋亡有密切关系，在凋亡进程中主要表现为 Bcl-2表达减少而Bax表达增多^[11]。本实验发现， 罗格列酮在诱导凋亡的过程中，可上调HepG2细 胞内p-p53及Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的 表达；而抑制p38MAPK通路后，罗格列酮对上 述蛋白的调控作用明显减弱，因此，我们推测罗 格列酮是通过激活p38MAPK通路，活化p53，并 使Bcl-2家族抗/促凋亡信号发生变化，最终实现 激活HepG2细胞的凋亡进程。同时本实验也证实 p38MAPK通路参与了对p53、Bcl-2和Bax蛋白的调 控。有研究表明，辛伐他汀可通过p38MAPK-p53 途径诱导大肠癌HCT116细胞的凋亡^[12]；Lee等^[13] 通过研究链球菌致热外毒素B(SPE B)诱导的凋 亡发现，p38MAPK通路位于p53的上游，激活 p38MAPK-p53途径可上调Bax蛋白表达。也有研究 发现，p38MAPK通路对Bcl-2家族的调控无需通过 P53的介导。Yang等^[14]发现，在栀子素经线粒体途 径诱导人非小细胞肺癌H1299细胞凋亡的过程中， 激活的p38MAPK通路可直接改变Bax/Bcl-2的比例；而Dong等^[15]认为p38MAPK通路是经由NF-κB 实现对Bcl-2家族调控的。

综上所述，罗格列酮可通过激活p38MAPK通 路抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并诱导其凋亡， 其机制可能与p38MAPK通路参与p-p53、Bax及 Bcl-2蛋白的调控有关。但p38MAPK通路抑制剂并 未完全逆转罗格列酮的凋亡诱导效应，提示我们 可能有其他信号通路参与其中。Wang等^[16]发现罗 格列酮可通过阻断TGF-beta通路抑制人神经胶质 瘤细胞的增殖，并认为P21和c-Myc基因也参与了 此过程；Liu等^[17]则发现罗格列酮可经由Wnt/GSK- 3β/β-catenin信号通路抑制人淋巴瘤细胞的增殖并 诱导其凋亡，因此有关罗格列酮抗肿瘤作用的分 子通路及其交互作用仍需进行深入的研究。