肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 为原发性肝癌的主要类型，根据世界卫生组织提 供的最新资料显示，全球每年约有60万人死于 HCC^[1]。在我国，乙肝病毒（hepatitis B virus， HBV）感染是肝细胞癌的主要病因之一，流行病学资料表明，慢性HBsAg携带者患肝癌的危险度 比非感染人群高25~37倍^{[2, 3]}。Toll 样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）是先天性免疫系统中能够 识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）的一种受体，分布于体内 各种细胞表面^[4]。研究表明TLR4在多种肿瘤中高 表达，尤其是炎症相关性肿瘤，TLR4可能通过促 进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡及免疫逃逸等 机制参与炎性反应相关性肿瘤的发生、发展^{[5, 6, 7, 8]}。 为了解TLR4基因不同表达对人乙肝病毒相关肝细 胞癌裸鼠移植瘤生长的影响，我们应用RNA干扰 （RNA interfering,RNAi）技术构建TLR4基因RNA 干扰的重组慢病毒载体，建立人乙肝病毒相关肝 细胞癌裸鼠移植瘤模型，观察重组慢病毒载体对 乙肝病毒相关性肝细胞癌裸鼠移植瘤TLR4基因表 达和肿瘤生长的影响。

15只雄性4~5周鼠龄裸小鼠（BALB/C-nu） 购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物许 可证号：SCXK（湘）2011-0003]，人HBV阳性 HepG3B肝癌细胞株购自中国科学院细胞库（上 海），Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，反 转录试剂盒购自Takara试剂公司，TLR4多克隆抗 体购自Santa公司。

人HBV阳性HepG3B肝癌细胞株 用含10%FBS的MEM培养液培养，加青霉素（100 u/ml）和链霉素（100 μg/ml），在37°C、5%CO₂ 恒温箱内培养。

由上海Invitrogen公司设计并构 建四种质粒及一种阴性对照质粒，TLR4干扰序列 见表 1。质粒抽提按照TIANGEN质粒大提试剂盒 说明书进行。

表 1 TLR4干扰序列及阴性对照序列 Table 1 TLR4 interference sequence and negative sequence

表选项

收集HepG3B 细胞，以1×105个/孔细胞铺六孔板，待细胞生长密 度至90%时按照Lipofectamine2000试剂说明书转 染（质粒DNA与脂质体比为1:3），48 h后收集细 胞，用Western blot检测TLR4蛋白表达，选择干扰 效果最好的质粒用于裸鼠实验。

将干扰效果最好的质 粒及阴性对照质粒送至上海Invitrogen公司进行慢 病毒包装。

培养的HepG3B细胞经胰 酶消化后离心，用PBS洗2次，将细胞团块吹散， 调整细胞浓度为每0.2毫升5×10⁶个。取5×10⁶个 （0.2 ml）细胞接种于每只裸鼠右后腿背部皮肤， 继续饲养。待肿瘤最长径约为0.8 cm时，随机分为 3组，即实验组、阴性对照组和空白对照组，每组 5只，分别向三组动物瘤内注射TLR4 miRNA慢病 毒颗粒（滴度为3.5×10⁷ TU/ml）、携带无关序列 的慢病毒颗粒(滴度为1×10⁸ TU/ml)和0.9%氯化钠 溶液，隔天1次，共5次。实验组和阴性对照组每 次瘤内注射慢病毒每只2×10⁷ TU，用无血清MEM培养液稀释至0.2 ml；空白对照组则每次瘤内注射 0.2 ml 0.9%氯化钠溶液，注射部位为肿瘤四周加中 央共五点。

每两天测量瘤体的 长径（a）与短径（b），并计算瘤体体积（TV）： TV=1/2 ×（a×b²），绘制肿瘤生长曲线。首次瘤内注 射后第11天颈椎脱臼法处死裸鼠，剥取瘤体组织。

Trizol法提取移植瘤组织的总 RNA，反转录成cDNA。TLR4引物序列为：正 义：5’-GGTCAGACGGTGATAGCGAG-3’，反 义：5’-ATTAGGAACCACCTCCACGC-3’，反应条 件为：94℃预变性5 min,然后94℃变性30 s,62℃ 退火 30 s,72℃ 延伸45 s，共33个循环，72℃延伸 8 min，扩增产物为179 bp；内参GAPDH引物序 列为：正义：5’-GTTGGAGGTCGGAGTCAACGGA- 3’，反义：5’-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA- 3’，反应条件为：94℃预变性5 min,然后 94℃变性30s,64℃退火30 s,72℃延伸45 s，共33个 循环，72℃延伸8 min，扩增产物为240 bp。PCR 产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后观察并拍照，实验 重复3次，并用凝胶图像处理系统分析目标带。

常规方法提取组织总蛋白，BCA法进行 蛋白浓度测定。取60 μg总蛋白上样，SDS-PAGE 电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一 抗（1：500）4°C孵育过夜，二抗（1：5 000）室 温孵育2 h，进行化学发光反应，暗室中显影、定 影。实验重复3次，将胶片进行扫描或拍照，用凝 胶图像处理系统分析目标带。

采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分 析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 Lipofectamin 2000转染效率检测

细胞转染后24 h，在荧光显微镜下观察绿色 荧光蛋白的表达情况，见图 1。随机取10个低倍视 野，计算转染细胞占细胞总数的百分比来评价转 染效率。结果显示6 μl脂质体包被2 μg质粒转染效 率达（48 ± 2.76）% 。

A: cellular morphology and distribution before transfection; B:the expression of green fluorescent protein after transfection 图 1 荧光显微镜下脂质体法转染miR-TLR4质粒24 h后绿 色荧光蛋白的表达 (×200) Figure 1 The expression of green fluorescent protein under the fluorescence microscope after transfected for 24 h (×200)

图选项

转染干扰片段1、2、3、4及阴性对照片段与对照组 相比，转染干扰片段3和4后，TLR4蛋白表达量显著减 少，且干扰片段3干扰效果最明显（P<0.05），见图 2。

A:TLR4 protein expression in different transfection groups;B:histogram of TLR4 protein expression; 1:non transfection group;2:negative fragment;3:interference fragment 1;4:interference fragment 2;5: interference fragment 3;6:interference fragment 4 图 2 不同转染组TLR4蛋白的表达 Figure 2 TLR4 protein expression in different transfection groups

图选项

慢病毒包装3号质粒用于实验组，根据每次 测量瘤体长径和短径计算出来的瘤体体积TV并 绘制出3组皮下移植瘤生长曲线，见图 3。空白对 照组和阴性对照组剥脱的瘤体体积分别为（2 263 ±180.67）mm³和（2 142±190.56） mm³，而实验 组剥脱的瘤体体积为（908±78.43） mm³，见图 3。结果表明，与空白对照组和阴性对照组相比， 实验组肿瘤生长速度明显减慢（P<0.05）；空白 对照组和阴性对照组相比，差异无统计学意义 （P>0.05）。

A:the size of subcutaneous tumors in different groups;B:growth curves of subcutaneous tumors in nude mice in different groups 图 3 各组移植瘤瘤体及生长曲线 Figure 3 The size and growth curves of subcutaneous tumors in different groups

图选项

实验组移植瘤组织在179 bp处的特异性条带 与空白对照组和阴性对照组相比更暗；半定量 RT-PCR结果分析表明，实验组TLR4 mRNA的表达量低于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）， 空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义 （P>0.05），见图 4。

A:the expression of TLR4 mRNA in subcutaneous tumors in different groups;B:histogram of TLR4 mRNA expression in subcutaneous tumors in different groups; 1:blank control group;2:negative control group;3:experimental group 图 4 RT-PCR分析各组裸鼠移植瘤组织TLR4 mRNA的表达 Figure 4 RT-PCR analysis of TLR4 mRNA expression in subcutaneous tumor tissues in nude mice in different groups

图选项

Western blot结果显示，实验组移植瘤组织中 TLR4蛋白表达量明显低于空白对照组和阴性对照 组（P<0.05），空白对照组与阴性对照组差异无 统计学意义（P>0.05），见图 5。

A:the expression of TLR4 protein in subcutaneous tumors in different groups;B:histogram of TLR4 protein expression in subcutaneous tumors in different groups; 1:blank control group;2:negative control group;3:experimental group 图 5 Western blot分析各组裸鼠移植瘤组织TLR4蛋白表达 Figure 5 Western blot analysis of TLR4 protein expression in subcutaneous tumor tissues in nude mice in different groups

图选项

Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）属 于Ⅰ型跨膜蛋白，系Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)中的一员，由细胞外区、跨膜区和细胞内 区三个部分组成。细胞外区由亮氨酸重复序列组 成，细胞内区由Toll同源结构域和羧基端长短不同 的短尾肽组成，同源结构域与白细胞介素-1受体 （IL-1R）胞质区结构相似，成为Toll样受体/白细 胞介素-1同源结构域（TIR）。TIR区域是TLR4与 其下游相关的信号转导分子，如髓样分化蛋白88 （MyD88）、IL-1相关蛋白激酶（IRAK）、肿瘤 坏死因子受体活化因子6（TRAF-6）和蛋白激酶 （AP）等相互作用的关键部位^{[9, 10]}。TLR4主要分 布于外周血单个核细胞和淋巴样组织，还分布于 其他组织细胞如肠道及胆道上皮细胞、库普弗细 胞、脂肪细胞、肝星状细胞等^{[4, 11]}。

近年来大量研究表明，TLR4与肿瘤密切相 关，尤其是炎症相关性肿瘤。有研究证实TLR4上 调与慢性炎症和肝纤维化形成有关，TLR4信号 能有效的激活NF-κB，从而促进肿瘤的发生发展 ^[12]；Jing等^[13]检测了106例肝癌组织标本中TLR4的 表达，其中101例（86%）标本显示TLR4阳性， 且进一步研究证实LPS诱发的TLR4信号涉及肝癌 的侵袭和转移，其机制可能是通过TLR4直接激活 NF-κB信号而实现的。同时也有研究认为(Helico-bater pylori,HP)是通过LPS-TLR4通路促进胃癌的 生长；Yokota等^[14]认为HP的LPS是通过LPS-TLR2- MEK1/2-ERK1/2MAPK-NF-Y通路上调TLR4表达 和促进胃癌细胞增殖。另外也有研究表明，TLR4 在炎症性肠病和结直肠癌的发生、发展中有重要 作用，且TLR4/MyD88信号通路与结直肠癌的预后 不良有关；在炎症性肠病向恶性肿瘤转化过程中 有多种分子机制参与，其中2个关键基因是COX-2 和NF-κB^{[15, 16]}。此外，Cheng等^[17]研究证实TLR4在 宫颈癌中高表达，由HPV LPS激活的TLR4信号有 促进细胞增殖和抗凋亡的作用，而且TLR4信号还 能通过激活NF-κB信号通路来促进免疫抑制因子 IL-6和TGF-B1的分泌，从而促进宫颈癌的发展。 可见TLR4的过度表达在肝癌、胃癌、结直肠癌和 宫颈癌等炎症相关性肿瘤发生过程中可能起促进 作用。

本实验设计并在体外化学合成4 对TLR4 - miRNA序列，利用脂质体转染法转入乙肝病毒阳 性肝癌Hep3B细胞中，通过Western blot技术检测转 染后TLR4基因蛋白水平的表达，从而筛选出干扰 效果最明显的序列用于裸鼠成瘤实验。在本研究 中，成功建立了人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移 植瘤模型，于瘤内注射重组慢病毒载体，利用RTPCR 和Western blot技术检测移植瘤组织中TLR4基 因mRNA和蛋白水平的表达，结果显示实验组移 植瘤组织内TLR4基因的mRNA和蛋白表达量都明 显下降。同时，通过绘制肿瘤生长曲线显示，沉 默TLR4基因后，明显抑制了裸鼠移植瘤的生长， 但其具体机制尚不清楚，有待进一步研究论证。

综合以上结果，本研究表明TLR4基因沉默表 达可抑制人乙肝病毒相关肝细胞癌裸鼠移植瘤的 生长，有可能为乙肝相关肝细胞癌的靶向治疗提 供一个新的思路。