0 引言 白血病是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病， 是导致儿童及35岁以下成年人死亡的最主要恶性肿 瘤，早期诊断、治疗及疾病监测至关重要。随着对 白血病发病机制的深入研究和治疗方案的改进，白 血病的完全缓解率得到较大提高，但其复发及耐药 问题也日益突出，严重影响化疗效果^[1]。近年来研究 发现，白血病的复发与微小残留病（minimal residual disease，MRD）密切相关^[2]。微小残留病是指经过诱 导治疗达到完全缓解时，患者体内残存的少量白血病 细胞。MRD是白血病复发的根源，MRD升高可提前 预示恶性血液病的全面复发，因此定期监测MRD， 对白血病的治疗和预后判断具有至关重要的意义。 MRD检测主要包括遗传学、分子生物学及免疫学的 特征，但很多患者并不具备相关的预后指标。随着对 白血病发病机制的深入研究，表观遗传学的异常改 变在白血病发病中的作用显得愈发重要^[3]。 1 DNA甲基化 表观遗传学研究内容主要包括DNA甲基化、 组蛋白修饰、染色质重塑、 RNA干扰及反义RNA 等。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在二核 苷酸胞嘧啶(CpG) 第5位碳原子上，在DNA甲基转 移酶(DNMT)的作用下,CpG 二联体中的胞嘧啶环 5′位的氢被S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代，从 而转变成5′-甲基胞嘧啶 (5-mC)。DNA甲基化主要 通过两种甲基转移酶的作用来完成：一类是重新 甲基化的甲基转移酶DNMT3a 和DNMT3b，另一 类是维持甲基化的甲基转移酶DNMT1。表观遗传 学研究证明DNA甲基化是一种基因外修饰，虽然 不改变DNA的一级结构，但在细胞正常发育、基 因突变、基因表达调控以及基因组稳定性中起着 重要作用，且这种修饰在细胞增殖过程中能稳定 传递，因此与肿瘤的发生密切相关。2 DNA甲基化异常与白血病的发生 DNA甲基化状态可影响基因结构和功能，某 些癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化是细胞癌 变的一个重要特征，在肿瘤的发生中起着极为重 要的作用。 在多种肿瘤中研究表明，肿瘤组织相对于正 常组织呈现普遍低甲基化状态。某些癌基因启动 子区域的去甲基化是肿瘤发生的早期事件，去甲 基化状态可能开放这些基因的转录从而上调基因 表达^[4]。白血病细胞中特异性基因的低甲基化包括 BCL2、髓过氧化物酶、c-myc等。 大量研究发现，在肿瘤细胞中，很多肿瘤抑 制基因都是通过表观修饰使基因发生了沉默^{[4, 5]}。 这些易感基因几乎涉及所有己知的细胞信息通 路，如控制细胞周期节点的生长调节因子(p15， p16，p73)^{[6, 7]}、细胞凋亡因子(FHIT,DAPK)、细 胞间黏附因子(E-cadherin)等，这些基因与细胞生 长、基因调控密切相关，大部分是抑癌基因，其 启动子高甲基化抑制基因表达，与白血病的发生 密切相关。而且研究发现，在急慢性髓系白血病 中DNMTl、DNMT3a和DNMT3b的表达均有不同 程度的上调^[8]。 Easwaran等^[5]研究阐明了高甲基化与低甲基化 共存的机制，可能与不同酶的催化及染色质结构 的区域性改变有关。基因组整体低甲基化和区域 性高甲基化对不同基因有选择性的作用，抑癌基 因的高甲基化可抑制基因表达，而原癌基因的低 甲基化可能激活基因表达。 3 DNA甲基化在白血病MRD监测及预后评估中的作用 近期研究表明，某些特定基因甲基化异常是 肿瘤发生的早期事件，可作为恶性肿瘤早期诊断 及检测残存肿瘤细胞的标志。Stutterheim等^[9]研究 表明，在神经母细胞瘤及乳腺癌、肺癌等恶性肿 瘤中，甲基化的RASSF1a是检测MRD的高度特异 性的DNA标志，而且适用于检测循环中的肿瘤细 胞。关于前列腺癌的研究中^[10]，PITX2基因高甲基 化的患者生物学复发风险增高，术后五年生存率 降低。在恶性血液肿瘤中，多种基因启动子区异 常甲基化与相应基因失活、MRD及预后有关。目 前研究表明，不同疾病状态下（初治、复发、完 全缓解）DNA甲基化水平与临床病情密切相关， 提示基因甲基化状态可作为一种独立的预后因素 评估肿瘤患者的复发风险。 目前p15基因甲基化与白血病的关系研究最为 深入。73％～93％的AML和57％的ALL患者发生 p15基因高甲基化，且持续p15基因高甲基化预示疾 病复发。与p15基因甲基化患者相比，非甲基化患 者无病生存期（disease-free survival，DFS）明显 延长。有研究对完全缓解期（complete remission， CR）的儿童AL患者检测p15基因甲基化状态，阳 性可预示疾病复发，阴性则预后较好^[11]，提示p15 基因甲基化检测对儿童白血病患者MRD的评估具 有重要价值。另有研究发现，在CR期的成人ALL 患者中，p73基因启动子区高甲基化与第一次CR 持续时间以及总生存期缩短之间有显著相关性。 Agrawal等^[12]在AML患者中以ER-a、p15INK4B基因高 甲基化为MRD标志进行了研究，结果发现：60％和 63％缓解期AML患者存在p15INK4B和ER-a基因高甲 基化，与非恶性疾病患者检出率有显著差异，甲基 化水平升高预示着复发风险增高以及无复发生存率 降低。在缓解期的儿童ALL患者中，ER-a和p15INK4B 基因甲基化水平与Ig/TCR基因重排及随后的复发密 切相关。 有研究发现，ZO-1和ID4基因启动子区域异常 甲基化与多种恶性血液病MRD检测及预后评估具 有重要意义。ID4及ZO-1基因在健康人中呈低甲 基化状态，而在急性白血病患者中均呈甲基化状 态，并且在CR时仍存在高甲基化的恶性克隆。有 研究对CR期白血病患者检测以上两种基因甲基化 状态，MRD的检出率分别为34.6%和41%，并且两 种基因甲基化阳性的患者1年内复发率显著高于非 甲基化患者^[13]。ID4及ZO-1基因甲基化检测同样适 用于多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患 者MRD的检测及预后评估^[13]。 越来越多的证据表明，AL患者DNA甲基化水 平与病情进展及多种预后指标（CR持续时间、总 生存期、无复发生存期等）密切相关，并且与相应 的白血病肿瘤负荷有显著的正相关性，对于白血病 患者MRD的检测及预后评估具有重要价值。完全 缓解期甲基化检测可提前1~3月发现微小残留病， 预测疾病早期复发，具有白血病MRD检测标志的 潜质。ZO-1、ID4、ER-a和p15INK4B等基因甲基化状 态的分析可作为一种生物标志物用于MRD的检测 及复发风险的评估。由于DNA甲基化水平与已知的 遗传学指标变化趋势相一致，证实了甲基化水平作 为急性白血病检测指标的真实可行性。甲基化特异 性PCR（MS-PCR ）技术作为一种高通量、高特异 度及敏感度的检测方法用于DNA甲基化的检测，可较为准确地检测MRD及预测疾病复发^[14]。 4 DNA甲基化抑制剂在白血病治疗中的作用 由于在正常细胞中CpG岛的高甲基化状态并 不普遍，因此诱导去甲基化是药物治疗高度特 异性的靶点。目前已知的去甲基化药物主要为 DNMT抑制剂，包括5-氮杂胞苷（5-Azacytidine， 5 -Az a ） 、5 - 杂氮- 2 ′ - 脱氧胞苷（ 5 - a z a - 2 ' - deoxycytidine）、三氧化二砷（As₂O₃）及反义寡 核苷酸抑制剂。研究表明去甲基化药物可以明显 延长肿瘤细胞的倍增时间，而对正常的原纤维细 胞没有影响。在不同的动物模型中都可以观察到 去甲基化药物可以阻止或逆转肿瘤的发生^[15]。 4.1 5-氮杂胞苷 5-Aza是三核苷酸衍生物发生了磷酸化，进 而插入DNA中与DNMT结合，导致DNA合成早期 缺乏DNMT，进而发生基因去甲基化。实验证实 5-Aza可激活p16和其他甲基化的肿瘤抑制基因的 表达，并且在用于异基因造血干细胞移植（allo- SCT）后复发的AML及MDS患者时，其中位生存 期明显延长^[16]。5-Aza现已被批准用于MDS低危及 高危患者的治疗，其三期临床试验证实5-Aza可改 善MDS患者骨髓象，使其白血病转化风险降低、 生活质量提高^[17]。 4.2 5-杂氮-2′-脱氧胞苷 又称为地西他滨(decitabine，DAC)，是一种 2′-脱氧胞苷类似物。DAC具有抗肿瘤活性且表现 为剂量相关的双重机制，高浓度时具有细胞毒作 用，低浓度时具有去甲基化作用。DAC被细胞摄 取后活化为DAC-TP，并插入细胞DNA中与DNMT 结合，从而使DNMT失去活性，导致相关基因的 去甲基化和重新表达，发挥治疗作用。Kopp等^[18] 研究表明，低剂量DAC纠正NK细胞恶性基因表达 的表型，大剂量可能通过直接抑制mRNA的转录 来抑制NK细胞增殖。有研究利用DAC处理白血病 U-937/THP-1细胞后，PRAME基因表达呈剂量依赖 性地上调^[19]，并且与5-Aza相比，DAC的去甲基化 作用较强^[20]。但由于DAC的毒性及水溶性不稳定， 限制了其临床应用。现已有一种胞嘧啶核苷类似物 zebularine，它是一种稳定的DNA甲基化抑制剂， 体内外毒性较小，可抑制细胞增殖，诱导凋亡，阻 滞细胞周期于G2/M期，而且与组蛋白去乙酰酶抑 制剂曲古抑菌素A（Trichostatin A）合用时,其基因 沉默效率及抑制细胞增殖的作用加强^[21]。 4.3 三氧化二砷 (As₂O₃) As₂O₃治疗急性早幼粒细胞白血病取得令人 瞩目的成就，其作用机制主要为通过诱导白血病 细胞凋亡和分化、下调端粒酶活性等发挥抗癌作 用。然而，越来越多的研究发现，砷剂在其代谢 过程中需要通过甲基化被解毒，其代谢过程与癌 基因及抑癌基因的甲基化过程惊人地相似。研 究发现低浓度的As₂O₃可通过去甲基化作用上调 p16INK4a、RASSF1A、E-cadherin和GSTP1基因的 表达，而且对DNMT也具有抑制作用^[22]。这提示 As₂O₃的确具有调控肿瘤细胞某些基因甲基化模式 的作用。所以，砷剂可作为又一种去甲基化药物 应用于临床。 4.4 DNMT1反义寡核苷酸抑制剂及siRNA 研究发现，DNMT1的反义寡核苷酸抑制剂或 siRNA敲除DNMT1可导致抑癌基因发生去甲基化 进而激活基因表达。DNMT1抑制剂在小鼠体内证 实可抑制肿瘤生长，临床试验中证实DNMT1抑制 剂在体内可引起DNA甲基化状态的改变，并且具 有抗肿瘤效应。大量数据表明DNMT蛋白是多功能 蛋白，除了催化DNA甲基化活性之外，还可以与 HDAC1、HDAC2及组蛋白甲基转移酶相互作用， 通过蛋白-蛋白之间相互作用抑制基因表达^{[23, 24]}。 提示DNMT抑制剂的抗肿瘤活性除去甲基化作用之 外，还包括DNMT水平的降低及功能抑制。 大量研究表明抑制DNMT的活性具有抗肿瘤 效应，然而使用甲基化抑制剂是否会引起基因组 普遍性低甲基化呢？近期研究表明，DNMT1水平 降低可引起DNA复制的S期阻滞，DNA复制减慢 可保护基因组免于普遍性低甲基化^[4]。目前已有 很多关于DNMT抑制剂的研究，这些药物可用于 白血病治疗的不同阶段：传统化疗之前或作为一 种维持治疗、在allo-SCT之前或移植复发之后^[25]。 DNMT抑制剂在临床中的应用还需要大量临床试 验提供数据支持。 5 结语和展望 基于以上研究，对白血病患者进行表观遗传学 改变的分析，特别是对某些标志性基因甲基化状 态的分析具有至关重要的意义：（1）可以初步判 断患者预后，并鉴别某些预后不良的疾病亚型^[26]； （2）运用MS-PCR技术检测微小残留病，突破了传 统检测方法的瓶颈，具有较高的特异性及敏感度， 对于监测白血病患者病情变化及预示复发具有重要 意义；（3）应用甲基化干预药物治疗白血病，为 设计新的化疗药物或联合化疗方案提供新的思路。