鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常见的头颈部恶性肿瘤，其发病有明显的地区 差异，中国华南地区为全世界最高发的区域。这 种区域集中发病模式提示鼻咽癌的发生可能与遗 传及环境因素有关，同时，EB病毒感染、环境中 化学致癌物质及以及基因位点的单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphisms,SNP）都可能是 NPC发病的影响因素^{[1, 2, 3]}。尽管近年来，放疗技术 和设备不断的更新，采用调强放疗和新辅助化疗相结合的综合治疗，使NPC的治疗效果较以往有 显著改善，但是，其5年总生存率仍然只有70%左 右^{[4, 5]}。因此，寻找易感基因，确定高危人群，提 高早期诊治率是目前鼻咽癌研究的热点之一。血 管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 是已知的最重要血管生成调控因子之一， 能特异性作用于血管内皮细胞，刺激内皮细胞增 殖，诱导血管形成。并且已有研究^[6]表明VEGF蛋 白的高表达与鼻咽癌患者的临床特征及预后关系 密切。VEGF-460 T/C位点的单核苷酸多态性可能 通过影响VEGF转录、表达而影响NPC的发生、 发展及预后。因而本研究旨在探讨广西人群中 VEGF-460 T/C基因多态性与NPC易感性的关系。 1 资料与方法 1.1 研究对象

选取2011年11月至2012年11月期间在广西医科 大学第一附属医院放疗科住院治疗的鼻咽癌患者 240例，年龄17~74岁，平均年龄（44.80±11.680） 岁。其中男179例，中位年龄46岁；女61例，中位 年龄45岁。入组标准：所有病例均为病理学诊断 的初治患者，分期标准参照鼻咽癌2008分期（中 国鼻咽癌临床分期工作委员 2008）。对照组为 同一时期在广西医科大学第一附属医院体检的健 康人群245例，年龄21~73岁，平均年龄（43.17± 12.663）岁。其中男189例，中位年龄47岁，女56 例；中位年龄45.5岁。入组标准：无肿瘤病史，无 耳鼻咽喉疾病史，与病例组之间无血缘关系。病 例与对照组人群通过流行病学面访调查，获得个 人的年龄、性别、民族、是否有肿瘤家族史及吸 烟情况等资料，其中吸烟情况分为吸烟指数＜400 和≥400。本研究经过广西医科大学伦理委员会批 准，所有研究对象均同意参加此研究并自愿提供 血液样本。 1.2 方法

治疗前采集研究对象的空腹静脉血5 ml， 枸橼酸钠抗凝，置于4℃冰箱保存。DNA提取 试剂盒为天根生化科技（ 北京） 有限公司产 品，按照说明书方法在采集血液标本后72 h内 提取外周血白细胞DNA，产物于-20℃条件下保 存，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 扩增目的DNA片段，引物由上海生工 生物技术有限公司设计并合成。上游引物：5’- TGTGCAGACGGCAGTCACAT-3’，下游引物：5’-C CCGCTACCAGCCGACTTT-3’，产物长度588 bp，PCR扩增反应体系（20 μl）：含Taq Master Mix 10 μl，上游引物0.6 μl，下游引物0.6 μl，DNA模板2 μl，超纯水6.8 μl。采用美国ABI公司的9700PCR扩 增仪，94℃预变性4 min，循环：变性94℃ 30 s， 退火 62℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，共进行循环35次， 终末延伸72℃ 2 min。PCR产物由北京三博远志生 物技术有限责任公司进行正向测序。

EBV-VCA-IgA试剂盒为美国RD公司分装， 按照说明书操作步骤用ELISA法检测，用酶标仪 在450 nm波长下测定吸光度（OD值），与临界值 （CUT OFF）相比较，CUT OFF值计算：临界值= 阴性对照孔平均值+0.15。 1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计分析，P＜0.05为 差异有统计学意义。对照组基因型频率进行Hardy- Weinberg平衡分析。采用卡方检验对病例组及对 照组的一般资料进行统计分析。用多因素非条件 Logistic回归法计算经性别、年龄、民族、吸烟情 况、EB-VCA-IgA抗体及肿瘤家族史等状况校正的 相对风险度的比值比（odds ratio，OR）及其95% 可信区间（confidence interval，CI）。 2 结果 2.1 测序结果

PCR扩增产物行基因测序，结果采用Chromas 软件分析峰图，人工读取具有双峰的碱基，即为 杂合子，单峰的碱基则为纯合子（图略）。 2.2 一般资料

鼻咽癌组与对照组在性别、年龄、民族、 吸烟指数≥400 方面比较差异无统计学意义（P >0.05）；鼻咽癌组中，具有鼻咽癌家族史和EBVCA- IgA阳性的人数明显高于对照组，两组的分 布差异有统计学意义 (P＜0.05），见表 1。

表 1 鼻咽癌病例组与对照组一般资料比较[n(%)] Table 1 Comparison of general data between NPC group and control group [n(%)]

表选项

VEGF-460T/C基因型T/T、T/C、C/C在对照组中 的频率分别为63.3%、32.2%、4.5%，经Arlequin软件 分析，基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg 平衡 (P>0.05），说明对照组为遗传平衡群体，具有代表性。 2.4 VEGF-460T/C基因型及等位基因在两组人群 中的分布及与鼻咽癌易感性的关系

本实验结果显示，VEGF-460T/C基因型及等 位基因在鼻咽癌组和对照组中普遍存在，统计结 果显示：VEGF-460T/C SNP T和C等位基因在鼻咽 癌组中的频率分别为72.5%、27.5%，在对照组中 的频率分别为79.4%、20.6%，鼻咽癌组中C等位基因的频率明显高于对照组，差异有统计学意义 （P=0.012，OR=1.458，95%CI：1.115~1.952），见 表 2，提示C等位基因可增加鼻咽癌的发病风险。两 组基因型差异无统计学意义（P>0.05）。

表 2 VEGF-460T/C 位点基因型和等位基因在病例组和对 照组中的分布 Table 2 Distribution of VEGF-460T/C locus genotype and allele in NPC group and control group

表选项

按照年龄、性别、病理类型、TNM分期进行分层分析，按照WHO2003分类进行病理类型分型， 按鼻咽癌2008分期对患者进行TNM分期。结果显 示：N0~1期组C等位基因的频率显著低于N2~3组 （OR=2.214，95%CI：1.276~3.842，P＜0.05），提示 C等位基因可增加NPC淋巴结转移的概率，见表 3。

表 3 VEGF-460 C/T 基因型和等位基因分布与NPC临床指标的关系 Table 3 Relationship between NPC clinical index and distribution of VEGF-460T/C genotype and allele

表选项

VEGF又名血管通透因子，由Ferrara等于1989 年从牛垂体滤泡星状细胞培养物中提纯分离得到， 它能够特异性地作用于血管内皮细胞，促进其增 殖，在体内诱导血管形成，并增加新生血管的通透 性。人类VEGF基因位于第六号染色体的P12~P21区，全长为14 kb，由8个外显子和7个内含子构成。 VEGF基因存在多个单核苷酸多态性位点，这些 多态性位点可能通过影响其转录和表达从而影响 VEGF蛋白的表达水平，其中位于启动子5-末端非 翻译区域的-460T/C与RNA的剪接有关，并且，目 前的实验证据趋向于认为其与VEGF的表达有关， 并且具有功能上的差别^{[7, 8]}，从而引起个体对肿瘤 易感性的差异。近年来，国内外临床研究报道了 VEGF-460基因多态性与多种恶性肿瘤关系密切。 台湾Ku等^[9]报道了VEGF-460 T/C基因型和等位基 因在病例组和对照组之间分布频率的多态性差异 有统计学意义(P<0.001)，并且认为该VEGF-460 可作为预测口腔癌发病的生物学标志物。Lin等^[10] 在研究台湾地区前列腺癌时也有类似的报道，但 Onen等^[11]认为VEGF-460基因型和等位基因多态性 与土耳其地区前列腺癌的发病无明显相关性(P> 0.05)，而且，VEGF-460基因型与该地区临床患者 的TNM分期、GS评分及血清PSA水平也无相关性 （P>0.05）。Chen等^[12]报道在携带有VEGF-460 T/C 和C/C基因型的结直肠癌患者中，肿瘤内和循环 VEGF水平较携带纯合子T/T基因型的患者VEGF水 平有明显增高(P＜0.01)，说明VEGF-460 T/C和C/C 基因型可增加VEGF蛋白的表达水平；在Ⅱ/Ⅲ期接 受根治性手术治疗的患者中，T/C和C/C基因型与 术前局部侵犯、淋巴结侵犯、组织分化程度差、和 术后转移、生存率的下降明显正相关(P＜0.01)；在 携带T/C和C/C基因型的远处转移患者对FOLFOX-4 方案化疗的敏感度较差(P=0.03)，生存率也相对较 短(P＜0.001)；笔者认为，VEGF-460是结直肠癌的 一个增加肿瘤复发及预后较差的独立性关键因素。 Masago等^[13]报道非小细胞肺癌中，携带有C/C基因 型的患者中位生存时间较短(P＜0.01)，提示C/C基因 型与非小细胞肺癌患者的不良预后相关。高峰等^[14] 报道国内肺癌患者中，携带有等位基因C增加了不 吸烟人群(P=0.006)及总体人群(P=0.0029)肺癌的发 病风险，同时，也增加肺鳞癌及小细胞肺癌的发病 风险（95%CI：1.058~3.295，OR=1.867；95%CI： 1.036~4.224，OR=2.092）。然而贾皑等^[15]发现，相 对于T等位基因，等位基因C可降低非贲门胃癌的 发病风险（95%CI：0.329~0.824，OR=0.52）。

本研究结果表明：在广西人群中，VEGF-460 SNPC与鼻咽癌的发生及淋巴结转移有一定的关 联，但具体的分子生物学机制以及VEGF-460 SNP C与鼻咽癌放疗敏感度、化疗耐受性以及预后的 关系尚不清楚，需要进一步的基础及临床研究证 实。同时，需要结合分析VEGF基因其他SNP对鼻 咽癌易感性的影响，为明确鼻咽癌发生机制、以 及对鼻咽癌的预防和早期诊治有重要意义。