肿瘤防治研究  2014, Vol. 41 Issue (10): 1082-1086
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管,湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

卢先州,刘龙飞,周筱筠,肖帅,龙建武,周贤. 2014.
WLU Xianzhou, LIU Longfei, ZHOU Xiaojun, XIAO Shuai, LONG Jianwu, ZHOU Xian. 2014.
肝细胞癌中GPR124的表达及与预后的关系
GPR124 Expression and Its Relationship with Prognosis in Hepatocellular Carcinoma
肿瘤防治研究, 2014, 41(10): 1082-1086
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2014, 41(10): 1082-1086
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2014.10.006

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收稿日期:2013-11-29
修回日期:2014-01-25
肝细胞癌中GPR124的表达及与预后的关系
卢先州, 刘龙飞, 周筱筠, 肖帅, 龙建武, 周贤    
421002 湖南衡阳,南华大学附属南华医院 普外科
摘要目的 研究G-蛋白偶联受体124(G protein-coupled receptor 124,GPR124)在人肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况,探讨其与HCC进展及预后的相关性。方法 选择 15对连续的新鲜冰冻HCC组织及相应癌旁肝组织标本,采取qRT-PCR检测GPR124 mRNA的表达; Western blot检测GPR124 蛋白的表达;另选择64例有完整随访资料的HCC石蜡标本进行免疫组织化学 法检测GPR124的表达。结果 新鲜冰冻HCC组织中GPR124 mRNA、蛋白的表达水平明显高于相应 的癌旁肝组织(P<0.05);石蜡切片免疫组织化学结果显示HCC组织中GPR124的表达明显高于相应 的癌旁肝组织(P<0.05);HCC中GPR124高表达与肿瘤大小、结节数目、TNM分期及微血管侵犯明显 正相关(P<0.05);HCC患者中GPR124高表达者总生存率、无瘤生存率明显下降(P<0.05)。结论 GPR124的高表达与HCC的进展密切相关,并导致不良预后,对其研究可用于评估HCC预后及研 发新的靶向药物。
关键词肝细胞癌     G-蛋白偶联受体124     侵袭转移     预后    
GPR124 Expression and Its Relationship with Prognosis in Hepatocellular Carcinoma
LU Xianzhou, LIU Longfei, ZHOU Xiaojun, XIAO Shuai, LONG Jianwu, ZHOU Xian    
Department of General Surgery, Nanhua Hospital Affiliated of Nanhua University, Hengyang 421002, China
AbstractObjective To investigate the expression of G protein-coupled receptor 124 (GPR124) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues, and to explore its relationship with HCC progression and prognosis. Methods qRT-PCR and Western blot analysis were used to detect GPR124 mRNA and protein expression respectively in 15 paired HCC and adjacent normal liver tissues. Immunohistochemical analysis was used to detect GPR124 expression in 64 cases formalin-fixed, paraffin-embedded HCC tissues with complete followup data. Results The levels of GPR124 mRNA and protein expression in HCC were significantly higher than those in adjacent liver tissues (P<0.05). GPR124 expression in paraffin-embedded HCC tissues were significantly higher than those in adjacent liver tissues (P<0.05). GPR124 expression were positively related with tumor size, tumor number, TNM stage and microvascular invasion (P<0.05). HCC patients with higher GPR124 expression had lower overall survival and disease free survival(P<0.05). Conclusion GPR124 overexpression has a significant correlation with the progression and prognosis of HCC, and it would provide a wonderful probability for predicting prognosis and designing new targeted drugs.
Key words: Hepatocellular carcinoma     G protein-coupled receptor 124     Invasion and metastasis     Prognosis    
0 引言

据WHO在2008年统计,肝癌位居男性恶性 肿瘤死亡率的第二位,女性的第六位;每年约 有748 300例新发病例,及695 900例肝癌相关死 亡病例,其中约一半发生在中国[1]。肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌的主要 组织亚型,占总病例的70%~85%。HCC目前死亡 率仍居高不下的主要原因是其高侵袭转移性,因 此有效地抑制其侵袭转移是目前肝癌最重要的研 究方向。肿瘤血管生成是恶性实体肿瘤的标志之 一,也是影响其侵袭转移的重要原因,而HCC是 一种富血管肿瘤,因此研究影响其血管生成的基 因对有效控制侵袭转移有重要意义[2]。最近研究发 现G-蛋白偶联受体124(G protein-coupled receptor 124,GPR124)表达升高与血管生成有密切联 系,这一特点可能导致其在促进肝癌侵袭转移进 而导致不良预后方面有重要作用。 1 资料与方法 1.1 资料与试剂 1.1.1 资料

收集2005—2008年南华大学附属南华 医院肝胆外科手术切除、具有完整随访资料、术 后经病理证实的HCC标本64例。其中男性51例, 女性13例;年龄23~82岁,中位年龄47岁。按第 七版AJCC/UICC中HCC的TNM分期标准,Ⅰ期 11例,Ⅱ期27例,Ⅲ期26例;Edmondson-Steiner 组织学分级Ⅰ级13例,Ⅱ级27例,Ⅲ级20例,Ⅳ 级4例。另取2012年该科连续切除HCC病例的新 鲜HCC组织及相应癌旁肝组织(距肿瘤边缘≥2 cm)15对,液氮速冻后存储于−80℃低温冰箱。 1.1.2 试剂

兔抗GPR124多克隆抗体(ab67280, Abcam公司),β-actin单克隆抗体(A5441, Sigma公司);二抗为通用型羊抗鼠/兔 IG-HRP ( P V- 6 0 0 0 ,中杉金桥公司) ;DAB 显色剂 (中杉金桥公司);TRIzol试剂(15596-026, Invitrogen公司);qRT-PCR试剂盒(QPS-201, Toyobo公司);蛋白定量试剂盒、ECL 发光液、 RIPA 细胞裂解液、PMSF为碧云天公司生产;其 余通用试剂均为国产分析纯。GPR124引物由上海 生工生物工程技术服务有限公司设计合成。 1.2 实验方法 1.2.1 SP二步法免疫组织化学染色

蜡块组织 连续切片,切片厚4 μm,切片置烤箱65℃烤片30 min,常规二甲苯、酒精脱蜡至水,置柠檬酸盐缓 冲液中,采用微波抗原修复20 min,加 3%H2O2室 温作用30 min阻断内源性过氧化物酶活性,10%正 常山羊血清室温封闭30 min,按说明书加GPR124 多克隆抗体(抗体浓度1:200),4℃过夜,加二 抗室温1 h,DAB显色,苏木精对比染色,PBS返 蓝,酒精、二甲苯脱水透明,中性树胶封片,显 微镜下观察,Olympus显微镜扫描取图。 1.2.2 Western blot方法检测GPR124蛋白的表达

取 低温存储的肝癌及相应癌旁肝组织,经液氮匀浆 研磨后,用RIPA及PMSF抽提法提取细胞总蛋白, Bradford法定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳,总蛋 白上样量10 μl,电压80 V 30 min,120 V 60 min电 泳,半干法转膜,电流为12 V,80 min,5%的脱脂 奶粉封闭30 min,常规TBST洗涤(pH=7.4),加 入GPR124多克隆抗体(抗体浓度 1:1 000),4℃ 过夜,常规洗涤,加入二抗,室温放置 1 h,常规 洗涤,加入 ECL 发光液,在 X线机下显影定影, 用扫描仪获取图像,β-actin 作为内参照。 1.2.3 qRT-PCR检测GPR124 mRNA的表达

取低 温存储的HCC及相应癌旁肝组织,经液氮匀浆研 磨后,采取TRIzol法提取组织总RNA,紫外分光 光度计测量A260/A280比值。取2 μg总RNA用AMV 反转录酶合成第一链,37℃ 15 min反转录反应, 98℃ 5 min酶失活反应。用2 μl的反转录产物作为 模板按试剂盒说明进行qRT-PCR。反应条件为: 95℃预变性1 min,95℃变性15 s、60℃退火30 s, 72℃延伸 1 min,共40个循环。GPR124基因片段 扩增上游引物为5'-GGTCGTTCTACTGGGCTGAT T-3',下游引物为5'-AGCAAGAGGGGATTTCACA AT-3',片段长度为108 bp。内参基因β-actin的上游 引物为5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3',下游 引物为5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3',片段 长度为285 kb。 1.3 阳性判定标准

由两位病理医师在“盲法”情况下对免疫组织化 学结果进行评估,显微镜下随机取5个视野,根据 每个视野中阳性细胞数占肿瘤细胞百分比和染色 程度强弱进行评分,无阳性染色记0分,阳性细胞 数≤25%记1分,阳性细胞数25%~50%记为2分, 阳性细胞数>50%~75%记为3分,阳性细胞数>75% 为4分;染色程度:无染色(-)为0分,微弱(淡 黄色 +)为1分,中等(黄色 ++)为2分,强染色 (棕褐色 +++)3分;阳性细胞数分值乘以染色程 度分值,两者之积为最后结果,结果总分12分, 分为4级,Ⅰ级:阴性(分值0~1分),Ⅱ级:弱 阳性(分值2~4分),Ⅲ级:中等阳性(分值5~8 分),Ⅳ级:强阳性(分值9~12分),Ⅰ级和Ⅱ 级为低表达(阴性或弱免疫反应),Ⅲ级和Ⅳ级 为高表达(中等或强免疫反应)。 1.4 病例随访

入选患者随访时间3~72月,中位随访时间38 月。患者手术完成出院即进行随访,常规采用血 清AFP及腹部B超进行复查,如怀疑复发者则进行 增强CT或MRI检查。术后1年每3月随访1次,术后 第2年每6月随访1次,此后每年随访一次。患者因 肝癌死亡、肝癌复发定义为完全数据,随访期间 生存、或因其他疾病死亡、或失访定义为截尾数 据。至随访结束时64例HCC患者中有47例复发,41 例死亡,1例失访。 1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件分析,计量资料以均数± 标准差(x±s)的形式表示,两两比较均值采用 Mann-Whitney-Wilcoxon检验(u检验),分类资 料统计的构成比采用χ2检验,各组间均数差异性的 比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 单因素生存曲线比较采取Kaplan-meier法。P<0.05 定义为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 HCC组织中GPR124 mRNA的表达情况

qRT-PCR检测15对HCC及相应癌旁肝组织显示 的GPR124 mRNA表达情况提示,HCC中GPR124 mRNA的表达显著高于相应的癌旁组织,差异有 统计学意义(P<0.05),见图 1

P<0.017, HCC vs. ANLT 图 1 GPR124mRNA在HCC及相应癌旁肝组织(ANLT) 中的表达 Figure 1 GPR124 mRNA expression in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and adjacent normal liver tissues(ANLT)
2.2 HCC组织中GPR124蛋白的表达情况

Western blot检测15对HCC及相应ANLT中 GPR124蛋白表达情况提示,GPR124蛋白在HCC 中明显高表达,而在相应的ANLT中表达明显较 低,见图 2

图 2 GPR124在HCC及ANLT中表达的典型图像 Figure 2 Typical GPR124 protein expression in HCCs and ANLTs
2.3 HCC、ANLT中GPR124免疫组织化学染色结果

HCC的细胞核异型性明显,大小、分化程 度不一,GPR124蛋白主要表达于细胞膜,呈淡 黄色、棕黄色或棕褐色,见图 3。GPR124蛋白在 HCC中的阳性率为76.6%(49/64),ANLT阳性率 为6.3%(15/64),HCC与ANLT中GPR124 蛋白阳 性率比较,差异有统计学意义(P <0.05),见表 1

A(× 100), B(× 400): positive expression of GPR124 in HCCs; C(× 100), D(× 400): negative expression of GPR124 in HCCs; E(×100), F(×400): negative expression of GPR124 in ANLTs 图 3 免疫组织化学法检测各组织中GPR124的表达情况 Figure 3 GPR124 expression in HCCs detected by immunohistochemical method
表 1 免疫组织化学法检测GPR124在HCC及相应ANLT中 的表达情况 Table 1 GPR124 expression in HCCs and relevant ANLTs detected by IHC
Notes: GPR124 levels in HCC group were significantly higher than those in ANLT group, P=0.019
2.4 GPR124的表达与HCC临床病理特征的关系

免疫组织化学分析GPR124的高低表达情况 与HCC的临床病理特征如年龄、性别、HBV感 染、血清AFP值、肝硬化、肿瘤大小、结节数 目、有无包膜、Edmondson分级、TNM分期、微 血管侵犯等的相关性。结果显示GPR124的表达 与肿瘤大小、结节数目、TNM分期和微血管侵犯 明显相关,且肿瘤越大、结节越多、TNM分期 越晚及存在微血管侵犯者GPR124呈明显高表达 (P<0.05),见表 2

表 2 GPR124的表达与肝癌临床病理特征的关系 Table 2 Correlation between GPR124 expression and clinicopathological characteristics of HCC
2.5 GPR124的表达与HCC患者预后的关系

由Ka p l a n -me i e r 生存函数曲线可以看出 GPR124高表达组HCC患者的总生存率(overall surviva l,OS)和无瘤生存率(disease free survival,DFS)均较低表达组下降,其差异有统 计学意义(P<0.05),见图 4

A:normoxia control group;B:hypoxia control group;C:hypoxia empty vector group;D:hypoxia experimental grouP</span> 图 4 不同GPR124表达的HCC患者总生存率和无瘤生存率 曲线图 Figure 4 Overall survival and disease-free survival curves of HCC patients with different GPR124 expression
3 讨论

肿瘤侵袭转移步骤可分为:原发肿瘤的增 殖;肿瘤新生血管生长;肿瘤细胞侵袭基底膜; 肿瘤细胞侵袭周围组织,穿入淋巴管、血管等; 肿瘤细胞在循环系统中存活,形成瘤栓并被运送 到靶器官,滞留于靶器官的微血管或淋巴管;穿 出血管、淋巴管形成微转移灶;微转移灶肿瘤血 管生成,转移灶增殖,进而在继发部位形成临床 转移灶,并再次侵袭、转移[3,4]。肿瘤通过这些步 骤进行转移并在远处靶器官定居,并为复发提供 条件。因此如何有效控制肿瘤新生血管形成对抑 制肿瘤的侵袭转移及复发有重要意义。

本试验通过多种方法检测血管生成相关基因 GPR124在HCC中的表达情况,并统计分析其与预 后的相关性。qRT-PCR检测发现在mRNA水平, HCC中GPR124的表达水平明显高于相应的癌旁 肝组织,而Western blot实验也证实在蛋白水平 GPR124在HCC中的表达亦明显高于相应的癌旁 肝组织,提示了GPR124可能与HCC有重要关联。 进一步通过免疫组织化学检测发现GPR124在多数 HCC中呈阳性表达,而在癌旁肝组织中大部分为 阴性表达,且GPR124的阳性表达与肿瘤大小、结 节数目、TNM分期及微血管侵犯明显正相关,提 示GPR124可能促进HCC的发展,并可能导致不 良预后。在对GPR124不同表达情况的HCC患者 进行生存分析发现,GPR124高表达组患者的总生 存率和无瘤生存率均明显低于低表达组,提示了 GPR124与HCC的不良预后相关。因此结合本试验 结果可以初步得出GPR124与HCC的侵袭转移密切 相关,并可作为评估HCC患者预后的指标之一。

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)是一个超级膜蛋白家族,可识各种各样的 细胞外信号分子,激活细胞内的异源三聚体的G 蛋白,活化后的G蛋白结合GTP置换GDP,进行三 聚体解离等变化,从而将信号传递到细胞内的效 应分子,引起细胞内的一系列变化,调控几乎所 有已知的生理过程,在临床上有着尤为重要的作 用,因此GPCR通路的异常将引起许多生理过程的 障碍进而导致各种疾病甚至肿瘤的发生[5]。GPCR 也是临床重要的药物靶点,目前市面上出售的各 种药物约30%是针对该受体设计的,如目前针对 酪氨酸激酶设计的治疗肿瘤的吉非替尼、曲妥珠 单抗、索拉非尼等[6,7]。GPR124属于B类GPCR, 最初因其在正常结肠内皮细胞与结肠癌细胞做基 因表达分析而发现,称之为TEM5,2004年正式命 名为GPR124。GPR124有七次跨膜结构,又称之 七穿膜蛋白结构,疏水区域与GPCR家族具有同源 性,其氨基端细胞外区较长,具有4个LRR(亮氨 酸富集区),分别为羧基端样LRR、免疫球蛋白 样LRR、激素受体样LRR[8]。最近有一系列重要的 关于GPR124与中枢神经系统的发育和血脑屏障形 成的关系的研究,发现GPR124缺失导致的前脑和 脊髓血管发育障碍,而过表达GPR124将导致血管 紊乱、血管壁增厚、血管高度扩张增生甚至形成血 管瘤样变,这与实体肿瘤的血管改变有明显的一致 性[9,10]

目前有限的关于GPR124功能的研究多集中于 中枢神经系统血管生成,但其具体作用机制的研 究极少[9,10,11]。在早期的一个研究中发现内皮细胞的 GPR124可能通过其羧基端的PDZ结合基与hDIg的 PDZ区结合,而通过对hDIg的锚定调控来调控细 胞增殖和黏附并进一步影响血管生成[12]。也有研 究发现在血管生成过程中内皮细胞脱落的可溶性 GPR124片段可以与一些黏多糖结合,这些片段 含有一个隐藏的可以与整合素αvβ3结合的RGD基 序,在MMP9的水解作用下,可溶性GPR124片段 通过与整合素αvβ3直接相互作用调节人脐静脉内 皮细胞黏附和存活,而这种黏附功能可以被整合 素αvβ3抗体拮抗,提示可溶性GPR124片段的水 解导致RGD基序的暴露可以通过连接整合素αvβ3 到黏蛋白的黏多糖侧链调节内皮细胞存活、黏附 和迁移等功能,并可能进一步调节血管生成[13]。 也有研究提示HUVEC中过表达TGF-β1明显增加 GPR124的水平,提示GPR124可能参与TGF-β信号 途径调节血管生成,但其确切机制仍待研究[9]

结合本试验,GPR124的高表达与HCC侵袭转 移及不良预后明显相关,预示了GPR124可能通过 调控血管生长促进肿瘤生长、转移而参与了HCC 这一富血管肿瘤的发生发展,这与目前国外研究 发现的GPR124能明显促血管生成,并导致肿瘤样 血管改变的研究结果相符。虽然GPR124调控血管 生成的具体机制研究仍较少,然而GPCR家族具有 良好的成药性,一旦进一步深入研究其在HCC中 调控血管生成的具体机制,将有助于研发出新的 HCC抑制血管生成的靶向治疗药物,因此深入探 索GPR124促进HCC侵袭转移的机制有重要的研究 价值。

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