文章信息
- 卢先州,刘龙飞,周筱筠,肖帅,龙建武,周贤. 2014.
- WLU Xianzhou, LIU Longfei, ZHOU Xiaojun, XIAO Shuai, LONG Jianwu, ZHOU Xian. 2014.
- 肝细胞癌中GPR124的表达及与预后的关系
- GPR124 Expression and Its Relationship with Prognosis in Hepatocellular Carcinoma
- 肿瘤防治研究, 2014, 41(10): 1082-1086
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2014, 41(10): 1082-1086
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2014.10.006
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文章历史
- 收稿日期:2013-11-29
- 修回日期:2014-01-25
据WHO在2008年统计,肝癌位居男性恶性 肿瘤死亡率的第二位,女性的第六位;每年约 有748 300例新发病例,及695 900例肝癌相关死 亡病例,其中约一半发生在中国[1]。肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌的主要 组织亚型,占总病例的70%~85%。HCC目前死亡 率仍居高不下的主要原因是其高侵袭转移性,因 此有效地抑制其侵袭转移是目前肝癌最重要的研 究方向。肿瘤血管生成是恶性实体肿瘤的标志之 一,也是影响其侵袭转移的重要原因,而HCC是 一种富血管肿瘤,因此研究影响其血管生成的基 因对有效控制侵袭转移有重要意义[2]。最近研究发 现G-蛋白偶联受体124(G protein-coupled receptor 124,GPR124)表达升高与血管生成有密切联 系,这一特点可能导致其在促进肝癌侵袭转移进 而导致不良预后方面有重要作用。 1 资料与方法 1.1 资料与试剂 1.1.1 资料
收集2005—2008年南华大学附属南华 医院肝胆外科手术切除、具有完整随访资料、术 后经病理证实的HCC标本64例。其中男性51例, 女性13例;年龄23~82岁,中位年龄47岁。按第 七版AJCC/UICC中HCC的TNM分期标准,Ⅰ期 11例,Ⅱ期27例,Ⅲ期26例;Edmondson-Steiner 组织学分级Ⅰ级13例,Ⅱ级27例,Ⅲ级20例,Ⅳ 级4例。另取2012年该科连续切除HCC病例的新 鲜HCC组织及相应癌旁肝组织(距肿瘤边缘≥2 cm)15对,液氮速冻后存储于−80℃低温冰箱。 1.1.2 试剂
兔抗GPR124多克隆抗体(ab67280, Abcam公司),β-actin单克隆抗体(A5441, Sigma公司);二抗为通用型羊抗鼠/兔 IG-HRP ( P V- 6 0 0 0 ,中杉金桥公司) ;DAB 显色剂 (中杉金桥公司);TRIzol试剂(15596-026, Invitrogen公司);qRT-PCR试剂盒(QPS-201, Toyobo公司);蛋白定量试剂盒、ECL 发光液、 RIPA 细胞裂解液、PMSF为碧云天公司生产;其 余通用试剂均为国产分析纯。GPR124引物由上海 生工生物工程技术服务有限公司设计合成。 1.2 实验方法 1.2.1 SP二步法免疫组织化学染色
蜡块组织 连续切片,切片厚4 μm,切片置烤箱65℃烤片30 min,常规二甲苯、酒精脱蜡至水,置柠檬酸盐缓 冲液中,采用微波抗原修复20 min,加 3%H2O2室 温作用30 min阻断内源性过氧化物酶活性,10%正 常山羊血清室温封闭30 min,按说明书加GPR124 多克隆抗体(抗体浓度1:200),4℃过夜,加二 抗室温1 h,DAB显色,苏木精对比染色,PBS返 蓝,酒精、二甲苯脱水透明,中性树胶封片,显 微镜下观察,Olympus显微镜扫描取图。 1.2.2 Western blot方法检测GPR124蛋白的表达
取 低温存储的肝癌及相应癌旁肝组织,经液氮匀浆 研磨后,用RIPA及PMSF抽提法提取细胞总蛋白, Bradford法定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳,总蛋 白上样量10 μl,电压80 V 30 min,120 V 60 min电 泳,半干法转膜,电流为12 V,80 min,5%的脱脂 奶粉封闭30 min,常规TBST洗涤(pH=7.4),加 入GPR124多克隆抗体(抗体浓度 1:1 000),4℃ 过夜,常规洗涤,加入二抗,室温放置 1 h,常规 洗涤,加入 ECL 发光液,在 X线机下显影定影, 用扫描仪获取图像,β-actin 作为内参照。 1.2.3 qRT-PCR检测GPR124 mRNA的表达
取低 温存储的HCC及相应癌旁肝组织,经液氮匀浆研 磨后,采取TRIzol法提取组织总RNA,紫外分光 光度计测量A260/A280比值。取2 μg总RNA用AMV 反转录酶合成第一链,37℃ 15 min反转录反应, 98℃ 5 min酶失活反应。用2 μl的反转录产物作为 模板按试剂盒说明进行qRT-PCR。反应条件为: 95℃预变性1 min,95℃变性15 s、60℃退火30 s, 72℃延伸 1 min,共40个循环。GPR124基因片段 扩增上游引物为5'-GGTCGTTCTACTGGGCTGAT T-3',下游引物为5'-AGCAAGAGGGGATTTCACA AT-3',片段长度为108 bp。内参基因β-actin的上游 引物为5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3',下游 引物为5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3',片段 长度为285 kb。 1.3 阳性判定标准
由两位病理医师在“盲法”情况下对免疫组织化 学结果进行评估,显微镜下随机取5个视野,根据 每个视野中阳性细胞数占肿瘤细胞百分比和染色 程度强弱进行评分,无阳性染色记0分,阳性细胞 数≤25%记1分,阳性细胞数25%~50%记为2分, 阳性细胞数>50%~75%记为3分,阳性细胞数>75% 为4分;染色程度:无染色(-)为0分,微弱(淡 黄色 +)为1分,中等(黄色 ++)为2分,强染色 (棕褐色 +++)3分;阳性细胞数分值乘以染色程 度分值,两者之积为最后结果,结果总分12分, 分为4级,Ⅰ级:阴性(分值0~1分),Ⅱ级:弱 阳性(分值2~4分),Ⅲ级:中等阳性(分值5~8 分),Ⅳ级:强阳性(分值9~12分),Ⅰ级和Ⅱ 级为低表达(阴性或弱免疫反应),Ⅲ级和Ⅳ级 为高表达(中等或强免疫反应)。 1.4 病例随访
入选患者随访时间3~72月,中位随访时间38 月。患者手术完成出院即进行随访,常规采用血 清AFP及腹部B超进行复查,如怀疑复发者则进行 增强CT或MRI检查。术后1年每3月随访1次,术后 第2年每6月随访1次,此后每年随访一次。患者因 肝癌死亡、肝癌复发定义为完全数据,随访期间 生存、或因其他疾病死亡、或失访定义为截尾数 据。至随访结束时64例HCC患者中有47例复发,41 例死亡,1例失访。 1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0软件分析,计量资料以均数± 标准差(x±s)的形式表示,两两比较均值采用 Mann-Whitney-Wilcoxon检验(u检验),分类资 料统计的构成比采用χ2检验,各组间均数差异性的 比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 单因素生存曲线比较采取Kaplan-meier法。P<0.05 定义为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 HCC组织中GPR124 mRNA的表达情况
qRT-PCR检测15对HCC及相应癌旁肝组织显示 的GPR124 mRNA表达情况提示,HCC中GPR124 mRNA的表达显著高于相应的癌旁组织,差异有 统计学意义(P<0.05),见图 1。
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P<0.017, HCC vs. ANLT 图 1 GPR124mRNA在HCC及相应癌旁肝组织(ANLT) 中的表达 Figure 1 GPR124 mRNA expression in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and adjacent normal liver tissues(ANLT) |
Western blot检测15对HCC及相应ANLT中 GPR124蛋白表达情况提示,GPR124蛋白在HCC 中明显高表达,而在相应的ANLT中表达明显较 低,见图 2。
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图 2 GPR124在HCC及ANLT中表达的典型图像 Figure 2 Typical GPR124 protein expression in HCCs and ANLTs |
HCC的细胞核异型性明显,大小、分化程 度不一,GPR124蛋白主要表达于细胞膜,呈淡 黄色、棕黄色或棕褐色,见图 3。GPR124蛋白在 HCC中的阳性率为76.6%(49/64),ANLT阳性率 为6.3%(15/64),HCC与ANLT中GPR124 蛋白阳 性率比较,差异有统计学意义(P <0.05),见表 1。
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A(× 100), B(× 400): positive expression of GPR124 in HCCs; C(× 100), D(× 400): negative expression of GPR124 in HCCs; E(×100), F(×400): negative expression of GPR124 in ANLTs 图 3 免疫组织化学法检测各组织中GPR124的表达情况 Figure 3 GPR124 expression in HCCs detected by immunohistochemical method |
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Notes: GPR124 levels in HCC group were significantly higher than those in ANLT group, P=0.019 |
免疫组织化学分析GPR124的高低表达情况 与HCC的临床病理特征如年龄、性别、HBV感 染、血清AFP值、肝硬化、肿瘤大小、结节数 目、有无包膜、Edmondson分级、TNM分期、微 血管侵犯等的相关性。结果显示GPR124的表达 与肿瘤大小、结节数目、TNM分期和微血管侵犯 明显相关,且肿瘤越大、结节越多、TNM分期 越晚及存在微血管侵犯者GPR124呈明显高表达 (P<0.05),见表 2。
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由Ka p l a n -me i e r 生存函数曲线可以看出 GPR124高表达组HCC患者的总生存率(overall surviva l,OS)和无瘤生存率(disease free survival,DFS)均较低表达组下降,其差异有统 计学意义(P<0.05),见图 4。
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A:normoxia control group;B:hypoxia control group;C:hypoxia empty vector group;D:hypoxia experimental grouP</span> 图 4 不同GPR124表达的HCC患者总生存率和无瘤生存率 曲线图 Figure 4 Overall survival and disease-free survival curves of HCC patients with different GPR124 expression |
肿瘤侵袭转移步骤可分为:原发肿瘤的增 殖;肿瘤新生血管生长;肿瘤细胞侵袭基底膜; 肿瘤细胞侵袭周围组织,穿入淋巴管、血管等; 肿瘤细胞在循环系统中存活,形成瘤栓并被运送 到靶器官,滞留于靶器官的微血管或淋巴管;穿 出血管、淋巴管形成微转移灶;微转移灶肿瘤血 管生成,转移灶增殖,进而在继发部位形成临床 转移灶,并再次侵袭、转移[3,4]。肿瘤通过这些步 骤进行转移并在远处靶器官定居,并为复发提供 条件。因此如何有效控制肿瘤新生血管形成对抑 制肿瘤的侵袭转移及复发有重要意义。
本试验通过多种方法检测血管生成相关基因 GPR124在HCC中的表达情况,并统计分析其与预 后的相关性。qRT-PCR检测发现在mRNA水平, HCC中GPR124的表达水平明显高于相应的癌旁 肝组织,而Western blot实验也证实在蛋白水平 GPR124在HCC中的表达亦明显高于相应的癌旁 肝组织,提示了GPR124可能与HCC有重要关联。 进一步通过免疫组织化学检测发现GPR124在多数 HCC中呈阳性表达,而在癌旁肝组织中大部分为 阴性表达,且GPR124的阳性表达与肿瘤大小、结 节数目、TNM分期及微血管侵犯明显正相关,提 示GPR124可能促进HCC的发展,并可能导致不 良预后。在对GPR124不同表达情况的HCC患者 进行生存分析发现,GPR124高表达组患者的总生 存率和无瘤生存率均明显低于低表达组,提示了 GPR124与HCC的不良预后相关。因此结合本试验 结果可以初步得出GPR124与HCC的侵袭转移密切 相关,并可作为评估HCC患者预后的指标之一。
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)是一个超级膜蛋白家族,可识各种各样的 细胞外信号分子,激活细胞内的异源三聚体的G 蛋白,活化后的G蛋白结合GTP置换GDP,进行三 聚体解离等变化,从而将信号传递到细胞内的效 应分子,引起细胞内的一系列变化,调控几乎所 有已知的生理过程,在临床上有着尤为重要的作 用,因此GPCR通路的异常将引起许多生理过程的 障碍进而导致各种疾病甚至肿瘤的发生[5]。GPCR 也是临床重要的药物靶点,目前市面上出售的各 种药物约30%是针对该受体设计的,如目前针对 酪氨酸激酶设计的治疗肿瘤的吉非替尼、曲妥珠 单抗、索拉非尼等[6,7]。GPR124属于B类GPCR, 最初因其在正常结肠内皮细胞与结肠癌细胞做基 因表达分析而发现,称之为TEM5,2004年正式命 名为GPR124。GPR124有七次跨膜结构,又称之 七穿膜蛋白结构,疏水区域与GPCR家族具有同源 性,其氨基端细胞外区较长,具有4个LRR(亮氨 酸富集区),分别为羧基端样LRR、免疫球蛋白 样LRR、激素受体样LRR[8]。最近有一系列重要的 关于GPR124与中枢神经系统的发育和血脑屏障形 成的关系的研究,发现GPR124缺失导致的前脑和 脊髓血管发育障碍,而过表达GPR124将导致血管 紊乱、血管壁增厚、血管高度扩张增生甚至形成血 管瘤样变,这与实体肿瘤的血管改变有明显的一致 性[9,10]。
目前有限的关于GPR124功能的研究多集中于 中枢神经系统血管生成,但其具体作用机制的研 究极少[9,10,11]。在早期的一个研究中发现内皮细胞的 GPR124可能通过其羧基端的PDZ结合基与hDIg的 PDZ区结合,而通过对hDIg的锚定调控来调控细 胞增殖和黏附并进一步影响血管生成[12]。也有研 究发现在血管生成过程中内皮细胞脱落的可溶性 GPR124片段可以与一些黏多糖结合,这些片段 含有一个隐藏的可以与整合素αvβ3结合的RGD基 序,在MMP9的水解作用下,可溶性GPR124片段 通过与整合素αvβ3直接相互作用调节人脐静脉内 皮细胞黏附和存活,而这种黏附功能可以被整合 素αvβ3抗体拮抗,提示可溶性GPR124片段的水 解导致RGD基序的暴露可以通过连接整合素αvβ3 到黏蛋白的黏多糖侧链调节内皮细胞存活、黏附 和迁移等功能,并可能进一步调节血管生成[13]。 也有研究提示HUVEC中过表达TGF-β1明显增加 GPR124的水平,提示GPR124可能参与TGF-β信号 途径调节血管生成,但其确切机制仍待研究[9]。
结合本试验,GPR124的高表达与HCC侵袭转 移及不良预后明显相关,预示了GPR124可能通过 调控血管生长促进肿瘤生长、转移而参与了HCC 这一富血管肿瘤的发生发展,这与目前国外研究 发现的GPR124能明显促血管生成,并导致肿瘤样 血管改变的研究结果相符。虽然GPR124调控血管 生成的具体机制研究仍较少,然而GPCR家族具有 良好的成药性,一旦进一步深入研究其在HCC中 调控血管生成的具体机制,将有助于研发出新的 HCC抑制血管生成的靶向治疗药物,因此深入探 索GPR124促进HCC侵袭转移的机制有重要的研究 价值。
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