Hmgb3是高迁移率族蛋白（high-mobility group box，Hmgb）成员之一，又称HMG2a、 HMG4，在进化中高度保守，于脊椎动物的胚胎 中高表达，大多数成体组织中不表达^[1]。研究显示 Hmgb3是维持小鼠白血病干细胞自我更新能力所 必需的基因^[2]。在实体瘤组织中，有报道^[3]Hmgb3 可作为检测外周血中肺癌细胞的标志物，并且在 评价肺癌的治疗和肺癌复发中具有重要的意义。 近期有研究表明在非小细胞肺癌患者中，Hmgb3 在mRNA及蛋白水平上癌组织明显高于癌旁组 织，而且其表达量与肿瘤分级、大小、临床分期 及淋巴结转移有关，是评估非小细胞肺癌预后的 独立因子^[4]。我们前期实验结果（待发表）显示 Hmgb3在肺腺癌的癌组织中高表达，提示Hmgb3 与肺癌肿瘤的发生与发展相关，但有关Hmgb3基 因的功能研究报道十分少见。

RNAi技术可通过shRNA在细胞中像在动物模 型中一样产生有效的、稳定的和可调节的基因沉 默作用^[5]。慢病毒可整合于基因组内，形成稳定表 达。本研究通过慢病毒载体介导的RNAi技术沉默 肺癌细胞中的Hmgb3基因，探讨其对肿瘤细胞增 殖的影响，为后续研究提供有效的研究工具。 1 材料与方法 1.1 实验材料

人肺腺癌A549细胞、人胚肾293T细胞、慢病 毒骨架质粒Tet-pLKO-puro（addgene）及包装质 粒（PHR’-CMV-8.2△VPR、 PHR’-CMV-VSVG） 为江苏大学基础医学与医学技术学院2510实验室 保存，DMEM及胎牛血清购自美国Gibco公司， LipofectamineTM2000 Reagent购自美国Invitrogen公 司，PCR试剂盒及胶回收试剂盒购自日本TaKaRa 公司，stbl3超级感受态及带GFP的腺病毒由江苏大 学基础医学与医学技术学院2510实验室制作，快 切酶(EcoRI、AgeI)购于立陶宛Fermentas公司，质 粒大提及小提试剂盒购自美国OMEGA公司，嘌呤 霉素、强力霉素及MTT购于美国Sigma公司，蛋白 酶抑制剂及PVDF膜购于德国Roche公司，PMSF、 BCA试剂盒购于中国碧云天生物公司，鼠抗人 β-Actin抗体购自美国Bioworld公司；兔抗人Hmgb3 抗体购自美国Epitomics公司。 1.2 筛选Hmgb3基因相对高表达的肺癌细胞株进 行干扰实验

肺癌细胞株A549、SCLC、SK-MES-1于 37℃、5 % C O 2饱和湿度培养箱中培养至对数 生长期，以2×105/ml密度接种于六孔板，培养 48 h，提取RNA及蛋白。mRNA反转录成cDNA 后，定量PCR取平均Ct 值，相对定量以2 - Δ Δ C t 表达（A549设定为1），Hmgb3：上游引物： 5’-GTCCGCTTATGCCTTCT-3’,下游引物:5’-GA CATCGTCTTCCACCTCT-3’；GAPDH：上游引 物：5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引 物:5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’；BCA法 测蛋白浓度，调成相同浓度后各取20 μl样品进行 SDS-PAGE凝胶电泳，200 mA转膜1.5 h，5%脱脂 奶粉室温下封闭1 h，兔抗人Hmgb3（1∶3000）、 鼠抗人β-actin（1∶5000）4℃过夜，二抗室温1 h， TBST洗膜后显色拍照，统计软件分析结果。 1.3 慢病毒质粒构建

到http://www.sigmaaldrich.com/网站搜索与 pLKO.1质粒相兼容的Hmgb3 shRNA 序列，如下： 上游序列：5’-CCGGGCCGTAATTGACACATCTCT TCTCGAGAAGAGATGTGTCAATTACGGCTTTTT G-3’，下游序列：5’ -AATTCAAAAAGCCGTAATT GACACATCTCTTCTCGAGAAGAGATGTGTCAAT TACGGC-3’，对照组GFP shRNA序列，上游序列： 5’-CCGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTCG AGATGAACTTCAGGGTCACGTTGCTTTTTG-3’， 下游序列：5’-AATTCAAAAAGCAAGCTGACC CTGAAGTTCATCTCGAGATGAACTCAGGGTC ACGTTGC-3’，由上海生工合成，用TE液稀释至 1 μg/μl，于95℃沸水中缓慢冷却至室温生成双链 RNA。慢病毒骨架质粒（Tet-pLKO-puro ）经EcoRI 及AgeI双酶切，胶回收酶切的骨架质粒，与退火 形成的双链干扰序列经T4 DNA连接酶连接，并转 入Stbl3超级感受态细胞中，挑取3个转化子，活化 后进行菌液PCR：上游引物：5’-GGCAGGGATA TTCACCATTATCGTTTCAGA-3’，下游引物：5-’ TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3’，取阳性菌液再 扩大培养行质粒小提得到较纯的重组慢病毒质粒。 1.4 慢病毒包装、收获

取对数生长的293T细胞种于10 cm皿中，用 不含双抗的10% FBS DMEM培养，第二天汇合度 达60%~70%时，换无血清DMEM，按重组慢病毒 质粒：包装质粒PHR’-CMV-8.2△VPR：包装质 粒PHR’-CMV-VSVG=4 μg∶3 μg∶1 μg的比例用 Lipofectamine^TM2000 Reagent共同转染293T，6 h后 换含10% FBS的DMEM继续培养。收集48、72 h的 病毒上清液，4℃ 3 750 r/min离心10 min去除细胞 碎片，分装于EP管中并于－80℃保存。 1.5 感染目的细胞

取对数生长的A549细胞种于六孔板内，第二 天细胞汇合度达60%~70%时感染病毒，换含聚凝 胺的培养液，每孔加入500 μl病毒液，聚凝胺最终 浓度为8 μg/ml。第二天重复感染一次，次日用嘌 呤霉素的最低杀死浓度（1 μg/ml）进行筛选。 1.6 筛选最佳诱导表达浓度

A549-pLKO-sh-GFP种于24孔板内，用强力霉 素（Doxycycline：0、4、8 μg/ml)诱导GFP shRNA 的基因表达，诱导24 h后加入带GFP的腺病毒10 μl 感染细胞，第二天于荧光显微镜下观察干扰效果。 1.7 诱导A549-pLKO-sh-Hmgb3细胞株的表达并 检测干扰效果

A549-pLKO-sh-Hmgb3及A549-pLKO-sh- GFP细胞以1×104/ml密度接种于96孔板（每孔200 μl），设两组诱导浓度（0、6 μg/ml），每组设5个 复孔，细胞贴壁后，换含有相应浓度诱导物（强 力霉素）的DMEM继续培养96 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT继续孵育4 h后终止培养，吸弃孔内 培养液，每孔加入150 μl DMSO，摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上 于490 nm处测量各孔的吸光值（A值）。以0 μg/ml 浓度为参照，计算在诱导浓度6 μg/ml下细胞的增 殖率，按以下公式计算：增殖率（%）=诱导表达 组/未诱导表达组×100%。 1.8 MTT法检测干扰Hmgb3后肺癌细胞增殖的变化

A549-pLKO-sh-Hmgb3及A549-pLKO-sh- GFP细胞以1×10⁴/ml密度接种于96孔板（每孔200 μl），设两组诱导浓度（0、6 μg/ml），每组设5个 复孔，细胞贴壁后，换含有相应浓度诱导物（强 力霉素）的DMEM继续培养96 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT继续孵育4 h后终止培养，吸弃孔内 培养液，每孔加入150 μl DMSO，摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上 于490 nm处测量各孔的吸光值（A值）。以0 μg/ml 浓度为参照，计算在诱导浓度6 μg/ml下细胞的增 殖率，按以下公式计算：增殖率（%）=诱导表达 组/未诱导表达组×100%。 1.9 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以均 数±标准差(x±s)表示，每组实验重复3次，组间 差异比较采用t检验，多组样本间的比较采用F检 验，P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 Hmgb3在肺癌细胞株中的表达

Hmgb3 mRNA水平上，SCLC及SK-MES-1表 达量均较低，不到A549的10%（P<0.05），见图 1A，蛋白水平表达情况同mRNA水平基本一致 （P<0.05），见图 1B，即Hmgb3在A549细胞中表达 量最高，为本研究的干扰对象。

A: relative expression level of Hmgb3 mRNA in different lung cancer cell lines; B: Hmgb3 protein expression in different lung cancer cell lines detected by Western blot 图 1 不同肺癌细胞系中Hmgb3 mRNA和蛋白质的相对表达 Figure 1 Expression levels of Hmgb3 mRNA and protein in different lung cancer cell lines

图选项

慢病毒骨架质粒约10 634 bp（图 2A凝胶泳道 2，同时可见两种质粒构象：超螺旋及闭环）经 EcoRⅠ、AgeⅠ双酶切后，形成两段（图 2A泳道 1，接近10 000 bp左右的片段为回收对象），连接 的转化子进行菌液活化后以菌液为模板行PCR实 验，连接成功的阳性克隆菌液得到351 bp DNA片 段（图 2B泳道2为pLKO-sh Hmgb3，泳道4为pLKOsh GFP），对照组（未酶切质粒，图 2B泳道6）得 到2 000 bp左右的DNA片段，阴性对照组未得到任 何片段，阳性克隆菌液提质粒后行质粒PCR，也出 现阳性结果，得到351 bp DNA片段（图 2B泳道3为 pLKO-sh Hmgb3，泳道5为pLKO-sh GFP，同时可 见到两种质粒构象）。

A: Tet-pLKO-puro plasmid double digestion; B: recombinant lentivirus plasmid 图 2 慢病毒骨架质粒（Tet-pLKO-puro）双酶切和重组慢 病毒质粒凝胶电泳鉴定图 Figure 2 Agarose gel electrophoresis diagram of lentivirus skeleton plasmid double digestion and recombinant lentivirus plasmid

图选项

慢病毒包装后，第二天细胞变圆变亮，病毒感 染A549细胞两天后，用最低杀死浓度的嘌呤霉素 筛选，三天后空白组细胞完全死亡，实验组留下被 病毒感染上的细胞，并用1/2最低杀死浓度维持培 养。设浓度梯度(0、4、8 μg/ml)的强力霉素，分别 诱导稳定细胞株A549-pLKO-sh-GFP干扰序列的表 达，第二天加入带GFP的腺病毒后在荧光显微镜下 观察荧光强度，结果随着诱导物浓度的增加，荧光 强度越弱，细胞状态于8 μg/ml出现较少凋亡细胞， 本实验筛选的最佳诱导浓度是6 μg/ml，见图 3。

Doxycycline (0, 4 and 8 μg/ml) induced A549-pLKO-sh-GFP which infected GFP adenovirus and obtained the best inducible concentration;A-C: fluorescent images; D-F:white light images 图 3 A549-pLKO-sh-GFP细胞筛选最佳诱导浓度 Figure 3 The best inducible concentration screened from the stable cell line A549-pLKO-sh-GFP

图选项

实验组及对照组细胞分别诱导表达48 h后，收 取蛋白行Western blot实验：在最佳诱导浓度下， A549-pLKO-sh-Hmgb3细胞目的条带比未诱导情 况下明显减少，而A549-pLKO-sh-GFP细胞未有 明显变化，见图 4A，进行灰度值分析，实验组细 胞诱导表达后干扰效果达73%以上（P<0.05）， 对照组细胞无明显干扰效果，差异无统计学意义 （P=0.721），见图 4B。即成功构建干扰Hmgb3 的慢病毒细胞株，且对照组A549-pLKO-sh-GFP对 Hmgb3无明显干扰效果。

A: Hmgb3 protein expression in two groups treated with and without doxycycline were detected by Western blot; B: histogram of Hmgb3 gray value in two groups treated with and without doxycycline; *: P ＜0.05, n=3; Dox: doxycycline 图 4 实验组与对照组在不同浓度强力霉素诱导下目的基 因Hmgb3的干扰效果 Figure 4 Interferential efficiency of Hmgb3 gene in experimental group and control group treated with different concentrations of doxycycline

图选项

诱导表达96 h后，对照组A549-pLKO-sh-GFP 细胞与未诱导情况下相比增殖无明显变化，增殖 率约为94%，差异无统计学意义，实验组A549- pLKO-sh-Hmgb3细胞比未诱导情况下增殖明显减 慢，增殖率为46%（P<0.05），即最佳诱导浓度的 诱导剂及干扰GFP对细胞无明显抑制作用，干扰 Hmgb3后明显抑制细胞增殖，见表 1、图 5。

表 1 强力霉素诱导及未诱导表达96h后细胞增殖MTT结果 Table 1 MTT results of A549 cell proliferation after treated with and without doxycycline for 96h

表选项

*P<0.05, n=3 图 5 在未诱导及诱导干扰序列表达96h后对照组与实验组 细胞相对增殖活力柱状图 Figure 5 Histogram of cell relative proliferation activity in experimental group and control group treated with and without doxycycline for 96h

图选项

在我国，肺癌已成为首位恶性肿瘤死亡原 因，占全部恶性肿瘤死亡原因的22.7%，5年生存 率仅15%^[6]。四大肿瘤治疗手段中虽然手术为首 选，但对于多数无法手术切除的肿瘤，基因治疗 成了一个可选的手段。

慢病毒载体在近年里由于其自身的优势逐渐成 为基因治疗及基因功能研究中的热点，由HIV-1载 体系统发展的第四代载体称可调控性慢病毒载体， Tet-pLKO-puro质粒就是其中一个代表^[7]。RNA干 扰是指由双链RNA引起的mRNA水平互补序列特 异性转录后基因沉默，是生物体进化过程中抵御 外来基因侵袭和病毒感染的保守机制[8-9]。本研究 成功构建了可诱导型慢病毒，并可根据诱导物的 量来调控干扰序列的表达情况，加入适当诱导物 后干扰效率可达73%左右，撤除诱导物后又可恢 复原来无干扰功能的状态^[7]；骨架质粒及包装质 粒均采用质粒大提，保障了质粒的浓度和纯度， 为后续酶切和转染成功提供了有效的保障。运用 Inoue 法制备超级感受态细胞，让shRNA、慢病 毒骨架质粒的连接产物转化成功率提高数倍。本 研究中包装病毒时，采用10 cm皿，在不影响细胞 状态的情况下，提高了质粒与脂质体量（8 μg∶ 16 μl)的量，使转染效率提高，保证了病毒包装的 成功。本研究中采用对照组sh-GFP来确定最佳诱 导表达浓度，比直接拿目的基因做浓度筛选更省 时省力，用不同浓度的诱导物强力霉素诱导A549- pLKO-sh-GFP干扰序列表达24 h后，加入带GFP的 腺病毒感染，在荧光显微镜下观察荧光表达强度 即可，十分直观，并可以同时设多个浓度观察， 较RT-PCR 或Western blot实验更加省时省力，且 效果一致。本实验室采用两次感染法感染目的细 胞，时间相隔24 h，大大增加了目的细胞感染病毒 的机率。

Hmgb家族包括Hmgb1、 Hmgb2和Hmgb3^[1]， 参与多种生物学过程，包括维持核小体结构、核 糖核酸形成、调节基因转录及DNA修复等^[10]。文 献报道Hmgb3参与急性淋巴细胞白血病的复发， 在进展期乳腺癌组织中的高表达^[11]与非小细胞肺 癌的临床预后差相关^[4]，但该基因的功能目前尚未 见报道。因此采用干扰技术，在高表达Hmgb3的 A549细胞中，干扰Hmgb3表达后，发现细胞增殖 明显减缓，这与我们前期在胃腺癌细胞株BGC823 中实验结果一致^[12]。Terada等^[13]在非洲爪蟾蜍中， 通过干扰实验也观察到Hmgb3能促进蟾蜍视网膜 祖细胞增殖。因此，推测Hmgb3基因的的过表达 导致细胞周期紊乱。但究竟Hmgb3是如何在肺腺 癌A549中影响细胞周期及其他功能，还有待进一 步研究。