宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一， 在全球范围内，每年约有20万女性死于宫颈癌。它 发病隐匿，侵袭性强，多伴有早期淋巴结转移，复 发率高，预后差。国内外大量研究发现，mTOR通 路的激活及其自身的过表达在多种肿瘤发生、进展 过程中起着重要作用，这为我们探求宫颈癌的生物 治疗靶点提供了新的突破点和思路。 该研究拟通过检测RNAi技术及雷帕霉素处理 前后宫颈癌HeLa细胞中mTOR、4EBP1 mRNA及蛋 白的表达情况，为雷帕霉素靶向治疗宫颈癌及临床 应用RNAi技术积累一定的理论数据。

1 资料与方法 1.1 病例资料

选取郑州大学第一附属医院及郑州人民医院 2007年1月—2009年3月的手术切除或宫颈活检组织 标本共95例，包括：（1）宫颈癌组织45例，病理 证实均为鳞状细胞癌，患者年龄在25~69岁，平均 年龄（52.8±8.25）岁，术前患者均未接受放疗、化 疗及其他治疗。宫颈癌病理分级：Ⅰ级16例、Ⅱ级 13例、Ⅲ级16例；按2000年 FIGO 临床分期：Ⅰ期 16例、Ⅱ期29例；记录有盆腔淋巴结转移14例、无 淋巴结转移31例；肿瘤直径≥4 cm 18例，＜4 cm 27例；（2）20例癌旁宫颈上皮内瘤变组织，其中 CINⅠ12例，CINⅡ8例。（3）30例因子宫肌瘤切 除子宫的正常宫颈鳞状上皮组织。所有标本经10% 中性甲醛固定，包埋，4 μm切片。

1.2 细胞系

人宫颈癌HeLa细胞系购自中国科学院上海生 命科学研究院。

1.3 主要试剂

siRNA的DNA模板购于北京奥科生物技术有 限责任公司；5'端生物素标记4EBP1 cDNA探针 (5'-CAGGTGAGTTCCGACACTCC-3')、5'端生物素 标记mTOR cDNA探针(5'-CTCAGCGGTAAAAGT GTCCCCTGCCA-3')、雷帕霉素和兔抗人4EBP1多 克隆抗体购于美国Santa Cruz生物技术公司；免疫 组织化学SP试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公 司；鼠抗人mTOR多克隆抗体购于美国SAB生物技 术公司。

1.4 方法 1.4.1 免疫组织化学检测组织中mTOR蛋白表

达 应用SP法，用已知的mTOR蛋白表达为阳性的 乳腺癌切片为阳性对照，用PBS 替代一抗作为阴性 对照。

1.4.2 免疫细胞化学检测HeLa细胞中mTOR、4EBP1蛋白表达

将固定好的细胞滴片按照试剂 盒说明进行染色，用mTOR蛋白阳性乳腺癌切片、 4EBP1蛋白阳性卵巢癌切片作阳性对照^[1]。用PBS 替 代一抗作为阴性对照。

1.4.3 原位杂交检测mTOR、4EBP1 mRNA表达

用RNase酶(0.1 mg/ml)预处理细胞滴片，酶解细胞内的 mRNA，严格按操作步骤进行。用mTOR mRNA阳 性乳腺癌切片、4EBP1 mRNA阳性卵巢癌切片作阳 性对照。用杂交液孵育组织切片作阴性对照。

1.4.4 结果判定

阳性信号均位于HeLa细胞质中， 免疫细胞化学为棕黄色、原位杂交是紫蓝色，每张 滴片在镜下随机选10个视野，按着色深浅和阳性细 胞所占百分比判定结果^[2]。（1）阳性细胞数：≤1% 的为0分；1%～25%的为1分；＞25%～50%为2分； ＞50%～75%的为3分；>75%为4分。（2）细胞着色 强度的计分：无显色的为0 分；淡黄色/淡蓝色为1 分；棕黄色/蓝色为2 分；棕褐色/紫蓝色为3 分。综 合（1）、（2）两项得分进行综合评分、统计学处 理。

1.5 统计学方法

用SPSS17.0软件分析数据，计量资料用均数±标 准差（x±s），用阳性率计算计数资料。比较阳性率 用χ2检验，用Spearman相关性分析。以α=0.05为检验 水准。

2 结果 2.1 mTOR蛋白在正常宫颈上皮、CIN组织和宫颈癌中的表达

mTOR蛋白在细胞质有棕黄色颗粒为阳性表 达，阳性表达率在正常宫颈上皮组织中为36.7% （11/30），CIN组织中为55.0%（11/20），宫颈癌组 织中为71.1%（32/45）。正常宫颈上皮、CIN组织与 宫颈癌组织中mTOR阳性表达率间差异有统计学意义 （χ2=8.740，P=0.013），见图 1。

图 1 免疫组织化学检测mTOR在正常宫颈组织（A）、CIN组织（B）及宫颈鳞癌组织（C）中的表达(HE ×200) Figure 1 Expression of mTOR protein in normal cervical tissue (A), CIN (B) and cervical squamous carcinoma (C) detected by immunohistochemistry(HE ×200)

mTOR蛋白阳性率在宫颈癌病理分级的整体间差 异无统计学意义 (χ2=2.734，P>0.05)。在临床分期的比 较中，临床Ⅱ期阳性表达率显著高于在Ⅰ期组织中 的表达 (χ2=5.386，P<0.05)；伴有淋巴结转移的宫颈癌 mTOR蛋白的阳性表达率明显高于不伴有淋巴结转移 者(χ2=4.678，P<0.05)。mTOR在宫颈癌组织中的阳性 表达率与病理学分级无关，和临床分期、淋巴结转 移有关。临床分期越晚，mTOR阳性表达率越高， 见表1。

表1(Table 1)

表1 mTOR蛋白的阳性表达与宫颈癌临床病理特征的关系 Table 1 Relationship of positive expression of mTOR protein with clinical pathological features of cervical carcinoma

表1 mTOR蛋白的阳性表达与宫颈癌临床病理特征的关系 Table 1 Relationship of positive expression of mTOR protein with clinical pathological features of cervical carcinoma

2.2 各组HeLa细胞中mTOR mRNA及蛋白表达情况 2.2.1 雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞mTOR mRNA及蛋白表达的影响

分别用100、150、200 nM/L三种不同浓度的 雷帕霉素处理宫颈癌HeLa细胞24、48和72 h，各 组与溶剂对照组及正常对照组相比，mTOR mRNA 和蛋白表达量均下降，差异有统计学意义（P均 <0.05）；随雷帕霉素浓度增加三个时间段内细胞 mTOR mRNA及蛋白的表达均减弱（P<0.05）， 同一浓度处理组中，随着时间延长，mTOR蛋白及 mRNA的表达也均降低 (P<0.05)；正常对照组和溶 质对照组细胞mTOR蛋白及mRNA间的表达差异无 统计学意义（P＞0.05），见表 2、图 2。

图 2 雷帕霉素作用后各组细胞mTOR蛋白（A~C）和mTOR mRNA（D~F）表达（HE ×200） Figure 2 Expressions of mTOR(A-C) protein and mTOR mRNA(D-F) in all groups treated by rapamycin(HE ×200)A,D:solute group;B,E:normal control group;C,F:rapamycin treatment group

表 2(Table 2)

表 2 雷帕霉素作用后各组细胞mTOR mRNA及蛋白的表达（x±s） Table 2 Expressions of mTOR mRNA and protein in all groups treated by rapamycin（x±s）

表 2 雷帕霉素作用后各组细胞mTOR mRNA及蛋白的表达（x±s） Table 2 Expressions of mTOR mRNA and protein in all groups treated by rapamycin（x±s）

2.2.2 mTOR siRNA对宫颈癌HeLa细胞中mTORmRNA及蛋白表达的影响

用50、100、150 nM/L三种不同浓度的mTOR siRNA分别转染宫颈癌HeLa细胞24、48、72 h， 各组与空白对照组、无关对照组及正常对照组相 比，mTOR mRNA及蛋白的表达差异均有统计学意 义（P均<0.05），mTOR siRNA转染的各组HeLa 细胞mTOR mRNA与蛋白的表达均低于各对照组， 且其表达随siRNA浓度增加、转染时间延长而减弱 （P均<0.05），见表 3、图 3。

图 3 mTOR siRNA 作用后各组细胞mTOR蛋白（A~C）和mTOR mRNA（D~F）表达（HE ×200） Figure 3 Expressions of mTOR protein(A-C)and mTOR mRNA(D-F) in all groups transfected with mTOR siRNA(HE ×200)A,D: solute group;B,E:normal control group;C,F:mTOR siRNA treatment group

表 3(Table 3)

表 3 mTOR siRNA转染各组 mTOR蛋白及mRNA的表达（x±s） Table 3 Expressions of mTOR protein and mRNA in mTOR siRNA groups（x±s）

表 3 mTOR siRNA转染各组 mTOR蛋白及mRNA的表达（x±s） Table 3 Expressions of mTOR protein and mRNA in mTOR siRNA groups（x±s）

2.3 各组HeLa细胞中4EBP1 mRNA及蛋白表达情况 2.3.1 雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞4EBP1 mRNA及蛋白表达的影响

三种不同浓度的雷帕霉素处理宫颈癌HeLa 细胞24、48、72 h，各组与对照组相比，4EBP1 mRNA及蛋白的表达量均有所下降（P均<0.05）； 各时间段内随雷帕霉素浓度增加，细胞4EBP1 mRNA及蛋白的表达均减弱（P<0.05），同一浓度 处理组中，随着时间延长，4EBP1 mRNA及蛋白 的表达也均降低 (P<0.05)，见表 4、图 4。

图 4 雷帕霉素作用后各组细胞4EBP1蛋白（A~C）和4EBP1mRNA（D~F）表达（HE ×200） Figure 4 Expressions of 4EBP1 protein(A-C)and 4EBP1 mRNA(D-F) in all groups treated by rapamycin(HE ×200)A,D: solute group;B,E:normal control group;C,F:rapamycin treatment group

表 4(Table 4)

表 4 雷帕霉素作用后各组细胞4EBP1 mRNA及蛋白的表达（x±s） Table 4 Expressions of 4EBP1 mRNA and protein in all groups treated by rapamycin（x±s）

表 4 雷帕霉素作用后各组细胞4EBP1 mRNA及蛋白的表达（x±s） Table 4 Expressions of 4EBP1 mRNA and protein in all groups treated by rapamycin（x±s）

2.3.2 mTOR siRNA对宫颈癌HeLa细胞中4EBP1mRNA及蛋白表达的影响

三种不同浓度的mTOR siRNA分别转染宫颈 癌HeLa细胞24、48、72 h，各组与对照组相比， 4EBP1 mRNA及蛋白的表达差异均有统计学意义 （P均<0.05），mTOR siRNA转染的各组HeLa细 胞4EBP1 mRNA与蛋白的表达均低于各对照组， 且其表达随siRNA浓度增加、时间延长而减弱（P 均<0.05），见表 5、图 5。

图 5 mTOR siRNA 作用后各组细胞4EBP1蛋白（A~C）和4EBP1mRNA（D~F）表达（HE ×200） Figure 5 Expressions of 4EBP1 protein(A-C) and 4EBP1 mRNA(D-F) in all groups treated by mTOR siRNA(HE ×200)A,D: solute group;B,E:normal control group;C,F:mTOR siRNA treatment group

表 5(Table 5)

表 5 mTOR siRNA转染后各组4EBP1 mRNA及蛋白的表达（x±s） Table 5 Expression of 4EBP1 mRNA and protein in all groups transfected with mTOR siRNA（x±s）

表 5 mTOR siRNA转染后各组4EBP1 mRNA及蛋白的表达（x±s） Table 5 Expression of 4EBP1 mRNA and protein in all groups transfected with mTOR siRNA（x±s）

3 讨论

宫颈癌是妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤之 一，其中90%以上是鳞状细胞癌。宫颈癌的发生、 发展是一个多因素作用、多阶段发展、多基因变 化的进行性演进过程。目前临床上用于宫颈癌治 疗的方法主要是外科手术治疗、化疗、放疗以及 综合治疗等，虽然诊疗技术在不断完善,但患者的 预后仍然较差，复发率较高。因此，寻求和开发 新的治疗宫颈癌的方法和分子靶点成为宫颈癌研 究领域的热点。

TOR基因是于1991年在酵母中发现的，随后 在哺乳动物体细胞也发现了结构和功能相似的 TOR蛋白质，称为哺乳动物TOR即mTOR。属于 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PIKK家族(ptdins3K-related kinase family)，它参与细胞众多的基本功能，例如 调控细胞周期、诱导细胞的凋亡和DNA的损伤后 修复作用等。mTOR是PI3K/AKT/mTOR信号通路中 最重要的下游效应蛋白之一，它可以整合许多种 生长因子以及生物信号，通过AMPK信号途径或 PI3K/AKT途径起作用，调控细胞生长和增殖 ^{[3, 4]}。 通常mTOR激活后调节蛋白合成的通路有两条，真 核细胞始动因子4E结合蛋白1(4E binding protein， 4EBP1)和核糖体S6蛋白激酶(S6 kinase，S6K)是 这两条通路的功能性蛋白。调节细胞内的蛋白合 成是mTOR的主要功能，4EBP1是其中翻译的负 调控因子，当4EBP1和eIF4E结合之后形成二聚 体，可以抑制eIF4E的翻译起始功能；当受到刺激 后，活化的mTOR使4EBP1磷酸化而失去活性，与 eIF4E分离，从而启动翻译过程^[5]。雷帕霉素能抑 制mTOR的活性，阻止4EBP1磷酸化，阻断蛋白质 翻译过程^[6]。mTOR和它下游的效应分子被激活， 使细胞异常生长^{[7, 8, 9, 10]}。目前，多种肿瘤都会出现 mTOR信号通路的调控异常。mTOR能调控与肿瘤 发生、发展密切相关的生理过程，如细胞生长、 细胞凋亡、细胞迁移等。

雷帕霉素是mTOR抑制剂，是20世纪70年代 从细菌中分离出来的一种大环内酯类抗生素。雷 帕霉素及衍生物如CCI-779、RAD001等通过特异 地抑制mTOR，从而抑制细胞生长，Smolewski等^[11] 在实验小鼠模型中，与对照组相比，注入雷帕霉 素的小鼠肿瘤明显减小。

RNAi是dsRNA介导的特异性基因表达沉默现 象，是生物界一种古老而且进化上高度保守的基 因表达调节机制。1998年首次发现将dsRNA注入 线虫可特异性抑制其基因表达，把这种由dsRNA 引发的抑制特定基因表达称为RNAi。

该研究采用雷帕霉素及RNAi技术作用宫颈癌 HeLa细胞，用原位杂交技术及免疫细胞化学法检 测细胞内mTOR mRNA及蛋白的表达。结果发现， mTOR siRNA组中，以150 nM mTOR siRNA转染 72 h的抑制作用最强；雷帕霉素组以200 nM作用72 h 抑制效应最明显。结果提示，雷帕霉素及mTOR siRNA对mTOR基因的抑制作用均具有浓度依赖 性及时间依赖性，这与侯桂琴等^[12]的研究结果基 本一致。mTOR siRNA在下调宫颈癌HeLa细胞中 mTOR基因表达的同时，4EBP1 mRNA及蛋白的表 达亦随之下调，提示mTOR作为4EBP1的上游调控 因子，可特异性调节4EBP1的表达。

mTOR信号通路在宫颈癌细胞的增殖、抗凋亡 及促血管形成等方面起着重要的作用，阻断mTOR 信号通路后，可以抑制宫颈癌细胞的增殖，促进 细胞的凋亡，所以，mTOR信号通路是宫颈癌基因 治疗中一个重要的分子靶点。本研究应用雷帕霉 素、mTOR siRNA分别处理宫颈癌HeLa细胞。结 果表明，雷帕霉素、mTOR siRNA均可抑制宫颈 癌细胞中mTOR及4EBP1基因的表达，抑制细胞增 殖，促进细胞凋亡。目前，雷帕霉素的抗肿瘤效 应已在临床前研究中得到证实，已经用于一些肿 瘤治疗的Ⅰ期、Ⅱ期实验，且具有一定的疗效。 RNAi作为一门新兴的基因阻断技术，具有简单、 高效，高特异性等特点，mTOR siRNA可以有效地 抑制宫颈癌细胞中的mTOR、4EBP1基因的表达， 这为临床应用RNAi技术靶向治疗宫颈癌提供理论 基础。