原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）简称肝癌，是我国乃至世界上常见且极具 危害性的恶性肿瘤之一，而引起患者死亡的主要 原因是侵袭和转移。因此，研究肝癌侵袭转移的 相关机制具有重要意义。

Rock2是Rho/Rock信号转导通路的关键信号分 子^[1]。我们的研究发现^[2]Rock2在肝癌中过表达， 而且Rock2与肝癌侵袭转移密切相关。有研究证 实，基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2， MMP2)与肝癌的侵袭转移密切相关。然而，Rock2 与MMP2两者在肝癌侵袭转移中的关联尚不清楚, 因此，本实验主要探讨原发性肝癌细胞中Rock2通 过调控MMP2对肝癌细胞侵袭和迁移的影响。

1 资料和方法 1.1 材料

DMEM培养液、胎牛血清（Gibco公司），脂 质体Lipofectamine™ LTX and Plus Reagent，RNA 提取试剂Trizol（Invitrogen公司）；限制性内切 酶BamH I、XhoⅠ、XbaⅠ，T4DNA连接酶， pyrobest DNA聚合酶，DpnI酶，质粒提取试剂盒， DNA凝胶回收试剂盒，一步法RT反转录试剂盒及 大肠杆菌DH5α感受态细胞（大连宝生物公司）； 蛋白提取试剂盒（北京普利莱公司）；BCA法蛋 白测定试剂盒（江苏碧云天公司）；MMP2一抗 （Protein-tech公司）；设计的Rock2 序列及相关 引物由上海生工公司合成；pcDNA5-FRT质粒、 Rock2 稳定低表达的肝癌细胞株及“恢复”Rock2 突 变质粒和HepG2细胞由江西省分子医学重点实验 室传代保存。

1.2 肝癌标本收集

收集南昌大学第二附属医院肝胆外科2012年1 月至2013年2月肝癌及癌旁组织标本各30 例，其中 男20例，女10例，患者平均年龄（60±6.20）岁， 标本收集后立即液氮保存，经病理切片证实为原 发性肝细胞癌。以上标本采集均由患者本人知情 同意并通过南昌大学第二附属医院伦理委员会审 核通过。

1.3 细胞培养及转染

HepG2 细胞株在37℃、5%CO2条件下于含 10%胎牛血清的DMEM 培养液中培养。按新型脂 质体Lipofectamine™ LTX and Plus Reagent转染试 剂说明用不含10%胎牛血清的DMEM培养液进行 转染，于转染4~6 h 后更换含有10%胎牛血清的 DMEM 培养液中继续培养，48 h后质粒高表达期 提取细胞RNA和总蛋白。

1.4 实时荧光定量PCR检测Rock2和MMP2的mRNA的表达

将H e p G 2 细胞分成： c o n t r o l 、P B S 、 siRNA(-)、Rock2-siRNA四组，提取mRNA，反 转录cDNA，用SYBR Green Ⅰ法，在ABI PRISM 7500自动荧光PCR仪进行荧光定量PCR检查MMP2 的mRNA表达水平，每个样品均做3个复孔，设定 阈值，测定平均的Ct值。

1.5 构建pcDNA5-FRT-Rock2重组质粒和“恢复”质粒

参照GenBank中Rock2的基因序列（NM_004850.3） 设计引物。提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA，以总 RNA为模板反转录为cDNA。进行PCR扩增反 应，利用T4 DNA连接酶连接ROCK2全长片段 与pcDNA5-FRT空载体，然后将连接产物转化到 DH5α感受态大肠杆菌，扩增后抽提质粒DNA，酶 切及测序验证。此外，为消除RNA干扰技术中的 脱靶效应，我们针对Rock2干扰序列，以pcDNA5- FRT-Rock2质粒为模板，利用PCR定点突变技术， 构建Rock2同义突变质粒。

1.6 Western blot检测Rock2及MMP2表达

实验分为空白对照组、稳定低表达Rock2组、 “恢复”Rock2组。提取各组肝癌细胞总蛋白，通过 BCA法测定蛋白浓度，取等量50 μg蛋白质样品煮 沸10 min 后行10% SDS-PAGE 电泳，转膜，然后 分别结合对应MMP2的一抗及辣根过氧化物酶标记 的二抗，最后利用化学发光法观察MMP2的表达情 况。

1.7 Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力

Transwell侵袭实验：取对数期生长的HepG2 细胞，经胰酶消化后按2×104细胞数加入每个小 室，用无血清的培养液进行培养，放置于含有10% 的FBS的培养液的24孔板上，5%CO2、37℃孵育 24 h，甲醛固定10～20min，用0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3 遍。显微镜下观察细胞，计数。

划痕实验：制备HepG2细胞悬液,通过细胞计 数，种植相同数量HepG2细胞于5 cm板中，培养过 夜后细胞均匀成单层铺满于每孔中，用相同大小 枪头进行划痕，每孔划痕粗细均匀，PBS清洗划下 的细胞，放入37℃、5%CO2不含血清的培养液， 细胞培养箱中培养，倒置显微镜下于0、12、24 h 拍照。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0 统计软件，数据以均数±标准 差(x±s)表示，癌及癌旁组织比较采用配对样本t检 验，多组均数之间比较采用单因素方差分析，两 两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05为差异有统计学 意义。

2 结果 2.1 Rock2与MMP2蛋白在肝癌组织中的表达及两者的相关性

Western blot法检测30例肝癌及癌旁组织中 Rock2和MMP2蛋白表达。结果发现：76.67% （23/30）的患者肝癌组织中Rock2和MMP2蛋白的 表达明显高于癌旁组织，23.33%（7/30）的患者 肝癌组织中Rock2和MMP2蛋白的表达与癌旁组织 相比差异无统计学意义。说明Rock2和MMP2蛋白 在肝癌组织中呈过表达。另外，我们进一步发现 Rock2和MMP2蛋白在肝癌组织中的表达呈正相关 （P=0.04，r=0.69），见图 1、表1。

图 1 Rock2与MMP2蛋白在肝癌和癌旁组织中的表达 Figure 1 Rock2 and MMP2 expressions in hepatocellular carcinoma and adjacent tissuesA:Rock2 and MMP2 protein expression in hepatocellular cancer tissue and adjacent tissue. Rock2 and MMP2 protein expressions in cancer tissue were higher than those in adjacent tissues (partial results) ; B:Rock2 and MMP2 expressions in cancer tissues showed high expression and positive correlation;T:tumor;NT:normal tissue

表1(Table 1)

表1 Rock2与MMP2蛋白在肝癌组织中表达的相关性 Table 1 Correlation of Rock2 and MMP2 expressions in hepatocellular carcinoma tissue

表1 Rock2与MMP2蛋白在肝癌组织中表达的相关性 Table 1 Correlation of Rock2 and MMP2 expressions in hepatocellular carcinoma tissue

2.2 降低Rock2对MMP2表达的影响

荧光定量PCR结果发现Rock2-siRNA组中 Rock2的mRNA表达较空白对照组、无义干扰组及 PBS组明显降低（P=0.02），而空白对照组、无义 干扰组和PBS组之间Rock2的mRNA表达量差异无 统计学意义。另外，MMP2的mRNA表达量随着 Rock2表达的降低而减少。说明降低Rock2可以抑 制MMP2的表达，见图 2。

图 2 干扰Rock2组Rock2和MMP2的mRNA水平的变化 Figure 2 Rock2 and MMP2 mRNA level changes in Rock2-siRNA group carcinoma and adjacent tissuesA: QT-PCR showed Rock2 RNA expression in Rock2-siRNA group was signifi cantly lower than other three groups, control group, siRNA (-) group or PBS group, with statistically signifi cant difference(P=0.02)；B: MMP2 RNA expression in Rock2-siRNA group was signifi cantly lower than control group, siRNA group or PBS group, with statistical signifi cance（P=0.03）

为了进一步明确Rock2对MMP2的调控，将转 染Rock2“恢复”质粒转染至稳定干扰Rock2的肝癌 细胞，Western blot结果发现Rock2“恢复”质粒可以 明显恢复Rock2蛋白的表达，同时MMP2蛋白的表 达随之明显增高，见图 3。

图 3 MMP2在正常、稳定低表达、“恢复”Rock2的HepG2细胞中的表达情况 Figure 3 MMP2 expressions in HepG2 cells in normal group, shRock2 group and "restore" Rock2 group carcinoma and adjacent tissues

2.3 Rock2调节MMP2对肝癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示：Rock2稳定低 表达组HepG2细胞穿膜细胞数（20±3.24）明显低 于空白对照组（69±7.83）及“恢复”Rock2组（59± 6.69）（组间F=9.36，P=0.04），空白对照组与“恢 复”Rock2组细胞穿膜细胞数差异无统计学意义， 见图 4。

图 4 Rock2调节MMP2对肝癌细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色 ×400） Figure 4 Effects of Rock2 regulating MMP2 on invasion of hepatocellular carcinoma（crystal violet staining ×400 ）

划痕实验结果显示：Rock2稳定低表达组 HepG2细胞的划痕愈合率比空白对照组和“恢复” Rock2组细胞划痕愈合率明显下降，差异具有统计 学意义（组间F=6.87，P=0.03），见图 5。

图 5 稳定低表达Rock2的HepG2细胞与正常和“恢复”Rock2的HepG2细胞迁移能力的比较 Figure 5 Comparison of HepG2 migration abilities in shRock2 group with normal group and "restore" Rock2 group

3 讨论

肿瘤的侵袭和转移是影响原发性肝癌患者生 存期的重要因素，在临床治疗过程中发现，HCC 的高转移和复发率是直接导致肝癌患者死亡的主 要原因，然而，关于原发性肝癌侵袭转移的具体 机制还不清楚，因此，对原发性肝癌侵袭转移相 关机制的研究显得十分重要^[3]。

Rock是Rho/Rock信号转导途径的一个重要信号 分子。哺乳类动物Rock家族包括两个成员：Rock1 和Rock2，相对分子量为160～170 kD，两者65%部分 存在完全一致性，90%的激酶区域存在同一性^{[1, 4]}。 Wong等^[3]报道Rock2在原发性肝癌组织的表达明 显增高且与肿瘤的转移密切相关。同时发现抑制 Rock2的表达可明显降低肝癌细胞的侵袭和转移能 力。本研究前期也发现Rock2蛋白在肝癌组织中明 显上调。总之，Rock2在肝癌的的侵袭转移中起重 要作用。然而，其具体的作用机制有待进一步研 究^{[5, 6]}。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs) 是Ca2+、Zn2+依赖的内源性蛋白酶家族。它们在肿 瘤生长、侵袭、转移及新生血管形成中起着重要 的作用^[7]。MMP2是MMPs家族中重要的成员，研究证 实MMP2与肿瘤的侵袭和转移密切相关^[8]。MMP2被 激活后可以形成Ⅳ型胶原酶降解和破坏靠近肿瘤表 面的细胞外基质，使肿瘤细胞向周围组织侵润，最 终导致肿瘤的局部侵袭和远处转移^[9]。上述研究表 明MMP2在肿瘤的侵袭转移中起关键作用。本研 究发现MMP2在肝癌组织中过表达，但是Rock2与 MMP2共表达在肝癌发生侵袭和转移中的作用仍不 清楚。

本研究首次分析Rock2与MMP2蛋白在肝癌组 织中表达的关联情况，结果发现Rock2和MMP2蛋 白在肝癌组织中表达存在正相关性。另外，我们 在肝癌细胞HepG2中利用RNA干扰技术降低Rock2 表达，结果发现随着Rock2表达下降，MMP2 mRNA和蛋白表达也随之下降。而且通过“恢复实 验”进一步证实恢复稳定干扰肝癌细胞中Rock2的 表达后MMP2 mRNA和蛋白表达均明显增加。上 述结果表明Rock2可特异性调控MMP2的表达。同时我们还发现在肝癌细胞HepG2中降低Rock2表 达，肝癌细胞的侵袭及迁移能力明显减弱，而在 稳定干扰Rock2表达的肝癌细胞中“恢复”Rock2表 达后，其迁移和侵袭能力也明显增强。上述结果 表明Rock2通过调节MMP2的表达可以影响肝癌细 胞的迁移和侵袭。

综上所述，本研究证实在原发性肝癌细胞中 降低Rock2表达可以降低MMP2的表达，从而抑制 肝癌细胞侵袭和迁移。目前，本课题组正在深入 寻找肝癌细胞中Rock2调控MMP2的具体分子生 物学机制，将可能为原发性肝癌的治疗提供新思 路。