去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是从我国传 统抗肿瘤中药斑蝥中提取的斑蝥素的衍生物，由 于其特殊的升白细胞作用，近年来被广泛应用于 临床对各种肿瘤的治疗和术后的化疗中，同时大 量的体外实验也证实了去甲斑蝥素有抑制肝癌、 乳腺癌、胆管癌^{[1, 2, 3]}等肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡的作用。但当前对结肠癌细胞的体外研 究报道较少，且其潜在的抑癌机制也有待研究。 STAT3通路的持续活化可导致细胞的异常增生， 抑制细胞凋亡，促使细胞向恶性转化，因此被公 认为是一种癌基因^{[4, 5, 6]}，同时大量研究表明在结肠 癌中存在JAK3和STAT3持续高表达，STAT3的持 续活化不仅促进结肠肿瘤的生长,并且促进肿瘤细 胞的扩散^{[7, 8, 9]}。近年来对NCTD抗肿瘤作用的研究 证实：NCTD可以通过调控细胞周期、诱导细胞 凋亡、抗肿瘤血管及淋巴管形成从而阻止肿瘤的 转移来实现其抗肿瘤作用^[10]。其中大量研究证实 了去甲斑蝥素可以通过线粒体通路激活caspase系 统引起肿瘤细胞的凋亡^{[11, 12]}，同时也有研究证实 NCTD可以通过分别激活JNK激酶依赖性通路、 TRAIL/DR5信号转导通路以及TR3依赖性通路来 抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡 ^{[13, 14, 15]} ,但对 于JAK-STAT通路研究报道较少。 本研究旨在探讨去甲斑蝥素对体外结肠癌LS- 174T细胞的生长抑制作用，同时研究去甲斑蝥素 作用下STAT3及其下游相关抗凋亡蛋白的表达，从 而探讨去甲斑蝥素可能的促凋亡机制,为临床的应 用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂

去甲斑蝥素和DMSO购自美国Sigma公司； RPMI1640购自美国Gibco公司， 四甲基偶氮唑盐 （MTT）购自Biosharp公司，吖啶荧光染料购自罗 莱宝科技有限公司，胎牛血清购自杭州四季青公 司，兔抗人bax、stat3、Mcl-1、survivin多克隆抗 体购自美国Bioworld公司，兔抗人β-actin单克隆抗 体购自美国Abcam公司，Annexinv凋亡检测试剂盒 购自北京宝赛生物试剂有限公司。 1.2 细胞系及细胞培养

人结肠癌LS-174T细胞购自中国生命科学院上 海生命研究所，以含10%胎牛血清、100 u/ml青霉 素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养液于温度 37℃、5%CO2温箱中培养，待细胞贴壁，取对数 生长期细胞进行实验。 1.3 MTT法检测去甲斑蝥素对LS-174T细胞的生长 抑制作用

取生长对数期的LS-174T细胞，将其消化成 单细胞悬液，调整细胞终浓度为1×105/ml，以每 孔200 μl接种于96孔培养板中，培养24 h，待细胞 贴壁后，弃上清液，分别加入质量浓度为5、10、 20和40 μg/ml的去甲斑蝥素培养，同时设空白组 （DMSO溶剂对照组）和阴性对照组（不加药物 组），每个浓度设6个复孔。加药作用24、48、72 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，于培养箱中继 续培养4 h，弃上清液，每孔加入200 μlDMSO，充 分振荡，使蓝紫色颗粒完全溶解。Ascent酶标仪检 测OD490值，计算细胞生长抑制率IR=（1－实验组 OD值/对照组OD值）×100%，绘制细胞生长曲线。 1.4 荧光显微镜下细胞形态学观察

将对数生长期的LS-174T细胞消化，收集并 调整细胞至1×105个/毫升，接种于6孔板中进行爬 片，培养24 h待细胞贴壁生长后，弃去培养液，分 别加入质量浓度为10、40 μg/ml的去甲斑蝥素，同 时设阴性对照组，培养箱中继续培养24 h后，弃上 清液，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定10 min，滴加 AO/EB等体积混合染料，迅速置于荧光显微镜下 观察并拍照。 1.5 透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化

收集0、10、40 μg/ml去甲斑蝥素作用24 h 后的结肠癌LS-174T细胞以2 000 r/min，离心10 min，小心吸尽上清液，沿管壁加入2.5%的戊二 醛，4℃保存，之后加入1%的锇酸4℃固定2 h，用 梯度丙酮脱水，用Epon 618纯化树脂浸透，包埋， 烤箱中聚合后，用莱卡（Leica）超薄切片机制成 切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，用透射 电子显微镜观察及拍照。 1.6 流式细胞术AnnexinV-FITC/PI染色法

收集阴性对照组细胞和药物组（5、10、20、 40 μg/ml）作用24 h后细胞，于室温2 000 r/min， 离心10 min，收集细胞，用预冷PBS重悬细胞， 2 000 r/min离心10 min，洗涤细胞，加入300 μl Binging Buffer 悬浮，加入5 μl AnnexinV-FITC混匀 后，避光，室温孵育15 min，上机前5 min加入5 μl PI,补加200 μl的1×Binding Buffer，上流式细胞仪检 测。 1.7 Western blot法检测 stat3、survivin、Mcl-1、 bax的蛋白表达

收集对照组和药物组（5、10、20、40 μg/ml） 作用24 h后细胞，PBS洗涤两遍，分别加入300 μl 蛋白裂解液，冰上作用1 h，12 000 r/min，离心10 min，取上清液，样品置于－80℃保存，Bradford 法测定蛋白质浓度，每个样品孔加入50 μg蛋白， 进行12%SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转移到 PVDF膜上，1%BSA 37℃封闭1 h，加入1:500稀释 的survivin、stat3、Mcl-1和bax多克隆抗体，室温振荡5 h，洗膜后，荧光二抗（抗兔lgG）避光孵育 1 h，洗膜，发光。 1.8 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计学分析，检验数 据用单因素方差分析和t检验，数据用均数±标准 差（x±s）表示。 2 结果 2.1 去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞的抑制作用

MTT结果表明：药物作用组NCTD（5、10、 20、40 μg/ml）作用24 h后，抑制率分别为(9.04 ±2.4)% 、(18.5 ±3.5) %、(40.1 ±5.8)% 、(58.2 ± 2.7)%；作用72 h后，抑制率分别为(18.14 ±7.4)%、 (36.7 ±4.3)% 、(49.9 ±3.6) %、(72.4±3.1)%（n=3， x±s）。最大抑制率在40 μg/ml作用72 h出现 ，见 图1。去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞有明显的 生长抑制作用，并且呈时间-剂量依赖性。 2.2 AO/EB 观察细胞形态学变化 正常组细胞呈均一绿染；10 μg/ml药物组细 胞体积减小，胞质减少，细胞核固缩，染色质浓 集，凋亡细胞增加；40 μg/ml药物组可见细胞核碎 裂以及凋亡小体，出现了典型的“鬼影”细胞，见图2。随着药物浓度的增加凋亡率明显增加。

图1 去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞生长的抑制作用 Figure1 Inhibitory effect of NCTD on cell proliferation of the human colon carcinoma cells LS-174T

图2 AO/EB染色观察结肠癌LS-174T细胞形态学的变化 Figure2 Morphology of human colon carcinoma cells LS-174T was detected by acridine orange/ethidium bromide staining

阴性对照组细胞的细胞核大、双核且各有一 个大而明显的核仁，细胞表面有些细长突起，10 μg/ml去甲斑蝥素作用24 h后，细胞微绒毛减少， 核体积缩小，核固缩，电子密度增加。40 μg/ml去 甲斑蝥素作用24 h后，核膜破裂，核染色质外排到 细胞质中，见图3。

图3 透射电子显微镜下观察去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞凋亡的影响 Figure3 Effects of NCTD on apoptosis of human colon carcinoma cells LS-174T observed under transmission electron

流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI染色法检测药物组和阴性对照组凋亡率，结果显示与阴性对照组 相比不同药物浓度（5、10、20、40 μg/ml）NCTD 作用24 h后，细胞凋亡率明显增加，且呈剂量依 赖性，各药物组之间凋亡率差异有统计学意义 （P<0.05），见图4，表1。

图4 AnnexinV/PI法检测NCTD诱导LS-174T细胞的凋亡 Figure4 Effects of NCTD on apoptosis of the human colon carcinoma cells LS-174T detected by AnnexinV/PI staining methods

表1(Table 1)

表1 AnnexinV/PI法检测NCTD诱导LS-174T细胞凋亡百分率 (x±s,n=3) Table1 Apoptosis rate of the human colon carcinoma LS-174T cells induced by NCTD was detected by AnnexinV /PI staining methods

表1 AnnexinV/PI法检测NCTD诱导LS-174T细胞凋亡百分率 (x±s,n=3) Table1 Apoptosis rate of the human colon carcinoma LS-174T cells induced by NCTD was detected by AnnexinV /PI staining methods

阴性对照组和药物组干预组（NCTD 5、10、 20、40 μg/ml）作用24 h后，检测stat3、survivin、 Mcl-1、bax蛋白表达情况。结果显示：stat3、 survivin、Mcl-1蛋白表达减少,bax蛋白表达增加,且 随药物浓度的增加表达也增加，呈明显的剂量依 赖关系，见图5。

图5 Western blot测定去甲斑蝥素对survivin、stat3、 Mcl-1、bax表达的影响 Figure5 Effects of NCTD on the expression of survivin , stat3,Mcl-1 and bax detected by Western blot

随着人民生活水平的提高和饮食结构的改 变，结肠癌在我国的发病率呈现出逐年上升趋 势，当前对于结肠癌的治疗主要以手术为主辅以 放化疗，但由于结肠癌的发病比较隐匿，出现症 状时往往已处于中晚期，错过了手术的最佳时 期，而单纯放化疗远期生存率并不理想，并且复 发率及转移率较高，尤其是晚期结肠癌生存率极 低，于是从传统中医药理论出发，用中药及其提 取成分治疗肿瘤为人们提供了新的治疗思路，并 且越来越多地受到国内外医学专家的重视。本实 验通过去甲斑蝥素(NCTD)对体外结肠癌LS-174T 细胞的作用，证实了去甲斑蝥素对结肠癌细胞存 在明显的生长抑制作用，并且呈时间-剂量相关 性。进一步应用AO/EB 染色以及AnnexinV/PI法检 测LS-174T细胞凋亡百分率，结果显示，去甲斑蝥 素作用下早期凋亡，晚期凋亡细胞数量随着药物 浓度的增加明显增加，提示去甲斑蝥素通过增加 凋亡来抑制结肠癌LS-174T细胞生长。同时应用透 射电子显微镜观察细胞超微结构发现，出现了细 胞表面微绒毛减少，胞核固缩、细胞核膜破裂，染色质外排等典型的凋亡形态学改变，更加证实 了去甲斑蝥素对结肠癌细胞的促凋亡作用。 JAK-STAT3 信号转导通路，参与肿瘤的发 生、发展，在许多人类肿瘤中被激活，成为目前 肿瘤信号转导通路研究的热点。 JAK-STAT 信号 通路由JAK酪氨酸激酶家族和STAT信号转导和转 录激活因子家族构成，STAT信号转导通路是表皮 生长因子(EGF)、JAK和IL-6等多个致癌性酪氨酸 激酶信号通道汇聚的焦点^[16],STAT3作为重要的信 号转导分子，通过激活靶基因而诱导某些关键产 物的表达来影响肿瘤的发生；重要的靶基因产物 包括影响细胞凋亡的Bcl-2家族成员。本实验应用 Western blot对NCTD作用结肠癌LS-174T细胞后相 关蛋白的表达进行检测，发现NCTD可以明显抑制 STAT3蛋白的表达，且呈剂量相关性，推测NCTD 促进细胞凋亡的机制可能与抑制JAK-STAT3的信 号通路活化有关。

Bcl-2家族包括抑制凋亡和促进凋亡两大类,前 者包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等，后者包括Bax、 Bak、Bcl-xS等^[17],髓样细胞白血病-1(Myeloid Cell Leuke-lia-1,MCL-1)基因属于BCL-2抗凋亡家族成 员之一，Mcl-1基因编码的蛋白主要位于细胞内膜 系统,尤其是线粒体膜,通过阻止Smac、细胞色素 C、AIF的释放来抑制细胞的凋亡，该基因的表达 异常与肿瘤的发生发展关系密切，而目前研究表 明JAK-STAT3 信号转导途径是调节Mcl-1表达的主 要途径^{[18, 19]}。既然NCTD可以抑制JAK-STAT3的信 号通路的活化，那么，Mcl-1的表达是否也发生相 应改变呢？Western blot结果显示，NCTD呈剂量 依赖性地抑制Mcl-1的表达，初步证明NCTD促进 细胞凋亡的机制可能与抑制JAK-STAT3的信号通 路、减少Mcl-1表达有关。

Bax为Bcl-2促凋亡家族成员之一，位于细胞 质，当细胞DNA受损时，可与Bcl-2形成同源或者 异源二聚体，拮抗bcl-2蛋白的抗凋亡功能，通过 激活线粒体凋亡通路，引起一系列caspase家族的 级联反应，最终导致细胞凋亡的发生^{[20, 21]}。与我 们预想一致的是NCTD呈剂量依赖性促进Bax的表 达，上述结果进一步说明NCTD诱导细胞凋亡的机 制与激活促凋亡基因和抑制抗凋亡基因的表达有 关。

Survivin为迄今为止发现的最强的凋亡抑制 因子（inhibitor of apoptosis，IAP），在正常分化 成熟的组织中几乎不表达， 而选择性地表达于多 种恶性肿瘤组织。 它除了具有促进细胞的抗凋亡和向恶性转化作用外，还有促细胞增殖、血管生 成和肿瘤转移的作用^[22]，虽然不属于bcl-2家族， 但研究表明survivin上具有STAT3结合位点，通过 抑制STAT3的表达可以减少survivin蛋白的表达， 从而促进肿瘤细胞的凋亡^{[23, 24, 25]}。本实验也发现， NCTD可以通过抑制STAT3信号通路减少survivin的 表达，与以往的报道相一致。

综上所述，本实验应用Western blot对NCTD 作用结肠癌LS-174T细胞后相关蛋白的表达进行检 测，发现NCTD可以明显抑制STAT3蛋白的表达， 且呈剂量相关性，进一步检测其下游调控蛋白 survivin、Mcl-1的表达，发现显示随着药物浓度的 增加它们的表达也随之减少，而促凋亡蛋白Bax表 达反而增加，这些结果表明去甲斑蝥素可能直接 或者间接参与了对JAK-STAT3凋亡通路的调节， 通过减少STAT3的磷酸化激活，并抑制其与下游抗 凋亡基因启动子结合，使相关凋亡蛋白的表达减 少，同时激活线粒体等凋亡通路，从而诱发结肠 癌细胞的凋亡。