Proteomics and Phosphoproteomics Analysis of Effect of Retinoic Acid-Induced Protein 16 Knockout on Human Colon Cancer Cells
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摘要:目的
分析人结肠癌HCT116细胞敲除维甲酸诱导蛋白16（RAI16）后细胞内总蛋白及磷酸化蛋白质表达的差异，探究RAI16影响HCT116细胞蛋白质功能的可能机制及相关信号通路。
方法收集并提取HCT116 KO和WT细胞蛋白，SDS-PAGE检验蛋白提取效果。利用胰蛋白酶酶解蛋白后，标记肽段并进行质谱分析。对鉴定到的差异蛋白及差异磷酸化蛋白质利用GO数据库、KEGG数据库和STRING数据库进行生物信息学分析。
结果SDS-PAGE结果提示蛋白无明显降解，且实验组与对照组部分关键条带有明显差异；按Foldchange≥1.5或Foldchange≤1/1.5且P<0.05为条件进行差异蛋白的筛选，共筛选出147个上调差异蛋白和230个下调差异蛋白；并筛选到106个上调磷酸化位点和217个下调磷酸化位点。将去本底差异磷酸化位点功能GO富集分析，发现差异蛋白主要在核质、细胞核及细胞质组成，RNA、钙黏着蛋白及染色质结合，DNA修复、RNA剪接及DNA为模板转录的正调控等多个方面有显著富集趋势。KEGG富集结果显示，差异蛋白主要在核质转运、剪接体、细胞周期、细胞间紧密连接、病毒致癌作用和癌症中的微小RNA等通路具有显著富集趋势。蛋白互作网络主要以 DDX17、NCL、EEF2、CDK1、SSRP1和SMARCC1为核心蛋白质。统计发现，SKP1、ORC1和BAD等两组学差异变化均上调，且磷酸化差异变化比蛋白差异变化更显著，RBL1、RB1、CDK1、CDC6、MCM4、TFDP1、CHD4和SNW1等两组学差异变化均下调，且磷酸化差异变化比蛋白差异变化更显著。
结论RAI16可能通过SKP1、ORC1、RB1和CDK1等关键蛋白质在多方面生物功能和多条信号通路中发挥作用，影响细胞周期，进而影响癌症发生发展。
Abstract:ObjectiveTo analyze the differences in the expressions of the total and phosphorylated proteins in human colon cancer HCT116 cells after the knockout (KO) of retinoic acid-induced protein 16 (RAI16) and explore the possible mechanism and related signaling pathways affecting its protein function in HCT116 cells.
MethodsHCT116 KO and WT cell proteins were collected and extracted, and the protein extraction efficiency was detected via a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) experiment. After protein digestion, the peptides were labeled with TMT and analyzed via mass spectrometry. We used bioinformatics methods to analyze the identified differential proteins and differentially phosphorylated proteins by using GO, KEGG, and STRING databases.
ResultsThe results of SDS-PAGE showed no evident protein degradation. In addition, some key bands were significantly different between the experimental and control groups. A total of 147 up-regulated and 230 down-regulated differential proteins were screened in accordance with the conditions of Foldchange≥1.5 or Foldchange≤1/1.5 and P<0.05. Meanwhile, 106 up-regulated and 217 down-regulated phosphorylation sites were screened. GO enrichment analysis revealed that the differential proteins were mainly enriched in the composition of nucleoplasm, nucleus and cytoplasm, RNA binding, cadherin and chromatin, DNA repair, RNA splicing, and positive regulation of DNA as template transcription. The results of KEGG enrichment indicated that the differential proteins were mainly enriched in nucleocytoplasmic transport, spliceosomes, cell cycle, cell-cell tight junctions, viral carcinogenesis, microRNAs in cancer, etc. The protein interaction network mainly focused on DDX17, NCL, EEF2, CDK1, SSRP1, and SMARCC1. The statistical findings unveiled the up-regulated changes in the two omics of SKP1, ORC1, and BAD and the down-regulated changes in RBL1, RB1, CDK1, CDC6, MCM4, TFDP1, CHD4, and SNW1. Moreover, the phosphorylation differences were more significant than the protein differences.
ConclusionRAI16 plays the possible crucial role in multiple biological functions and signaling pathways through key proteins, such as SKP1, ORC1, RB1, and CDK1, which affect the cell cycle and thereby the occurrence and development of cancer.
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Key words:
- Colon cancer /
- Retinoic acid-induced protein 16 /
- HCT116 cells /
- Phosphoproteomics
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0 引言
2017年美国预防服务工作组（US Preventive Services Task Force, USPSTF）基于最新证据对1996年USPSTF推荐进行了更新，与1996年推荐一致，反对应用颈部触诊和超声对无症状成人行甲状腺癌筛查（推荐级别D）[1]。近年来我国甲状腺癌的发病率呈现增高趋势，非必要的甲状腺结节手术率也显著升高，甲状腺结节的过度诊断和过度治疗问题日益突出[2-5]。
1 甲状腺癌诊疗的现状
甲状腺结节为常见的临床问题。碘充足地区人群中通过触诊的检出率女性为5%，男性为1%。随机人群借助高分辨率超声的检出率为19%~68%，其中7%~15%为甲状腺癌。1975年美国的甲状腺癌发病率为4.9/10万人，之后逐渐增长，2013年为15.3/10万人。1997—2009年甲状腺癌的发病率每年增长6.7%[6]。但是近年来（2009—2013年）增长率放慢至2.1%。与此同时，死亡率每年仅增加了0.7/10万人[6]。大多数甲状腺癌预后良好，五年生存率为98.1%。与美国相似，世界其他国家的甲状腺癌发病率也迅速增加，成为发病率增加最快的恶性肿瘤。
2003—2007年中国甲状腺癌发病率和死亡率呈上升趋势，每年分别以14.51%和1.42%的速度上升[7]。2014年我国甲状腺癌的发病率为12.40/10万人，中标发病率为9.29/10万人，为女性肿瘤的第四位。在30岁以下的女性中，甲状腺癌为最常见的恶性肿瘤[8]。预计2015年，中国将有9.00万甲状腺癌新发病例，死亡人数为0.68万人[9]。人口老龄化、不健康的生活方式、医疗保险的覆盖率增加及医疗技术的进步可能是甲状腺癌发病率升高的原因，但尚缺乏相应的证据。目前我国整体的甲状腺癌诊治水平较欧美发达国家存在着一定差距，指南共识多采用国外数据制定。医疗资源地区分布不均，诊疗水平参差不齐，尚需要全国范围内推广甲状腺细针穿刺活检和甲状腺癌的规范治疗等诊疗技术。
2 USPSTF推荐声明及更新
2017年USPSTF推荐声明：反对无症状人群行甲状腺癌筛查。但不适用于伴有声音嘶哑、疼痛、吞咽困难和其他咽喉症状的患者，也不适用于颈部肿物、颈部肿大和颈部不对称及其他原因需要颈部检查的患者。同样不适用于因电离辐射暴露史（医学治疗和核辐射）而使甲状腺癌风险增加的人群，特别是低碘饮食人群、与甲状腺癌相关的遗传基因综合征（如家族性腺瘤肌肉病）或者一级亲属有甲状腺癌史的人群[10-11]。
1996年USPSTF推荐婴幼儿时期上身（主要是头颈部）有外放射史的无症状成人行甲状腺癌筛查（推荐级别C定义为无充分证据的推荐或者反对）。2017年更新虽然推荐级别依然为C，但C的定义发生了改变，见表 1。与1996年相比，指南没有改变其余无症状人群筛查的态度。
表 1 USPSTF的分级意义和实践推荐Table 1 Meaning of USPSTF grades and suggestions for practice
3 甲状腺癌筛查的准确性
应用颈部触诊或超声行甲状腺癌筛查的准确性证据是有限的，每种筛查方法只有两项适用研究，在筛查人群中采用同一参考标准来比较这两种筛查方法。两项来自芬兰的高质量前瞻性研究显示颈部触诊对甲状腺结节的诊断敏感度低[12-13]。一项随机选择成人（n=253）的研究，5.1%颈部检查发现异常（甲状腺结节或弥漫性增大），其特异性和敏感度分别为11.6%（95%CI: 5.1%~21.6%）和97.3%（95%CI: 93.8%~99.1%）[12, 14]。另一项关于接受乳腺摄影女性人群的甲状腺癌筛查研究（n=101）显示甲状腺超声有异常发现的女性，颈部触诊发现甲状腺结节的敏感度为27.8%（颈部触诊阴性的女性未随访，因而假阳性率无法评估）[13-14]。
两项基于韩国人群的高质量研究，报道了仅采用超声筛查的诊断准确性[15-16]。一项前瞻性研究（n=2 079接受筛查，113名接受了细针穿刺活检术）显示超声筛查发现1项或者更多的恶性特征（微钙化或形状不规则）的敏感度和特异性分别为94.3%（95%CI: 84.3%~98.8%）和55.0%（95%CI: 41.6%~67.9%）。另一项回顾性研究分析了1 009名患者基于超声发现（2项高危超声特征）筛查出130名无症状成人行细针穿刺活检术，结果显示敏感度和特异性分别为94.8%和86.6%（计算每一个甲状腺结节而不是每一名患者）。但是这个研究没有随访超声阴性的患者，因而可能过度评估了超声的敏感度。
甲状腺细针穿刺细胞学是术前评估甲状腺结节性质敏感度、特异性最高的方法，为国内外指南所推荐，以减少过度治疗的概率。2015年美国甲状腺学会《成人甲状腺结节与分化型甲状腺癌诊治指南》指出，直径≤1.0 cm高度可疑恶性的甲状腺结节，推荐密切随访，不主张行积极的细针穿刺活检。我国指南则相对温和，2018年《超声引导下甲状腺结节细针穿刺活检专家共识及操作指南》指出：直径≤1.0 cm无高危因素的甲状腺结节，不推荐常规行穿刺活检。学术界对于细针穿刺活检的态度也趋向于保守。
4 筛查相关早期诊断和治疗的获益
USPSTF推荐认为，对无症状人群行甲状腺癌筛查，无论是通过颈部触诊还是超声检查，均无获益的明确证据。除罕见类型甲状腺癌，患者治疗和随访的获益无明显差异。观察到的证据显示，引入基于人群的筛查系统后死亡率并没有改变。
没有研究直接对比筛查人群与未筛查人群的预后。也没有随机试验评估接受早期治疗和筛查相关治疗的分化型甲状腺癌患者的预后是否优于观察组（推迟或不治疗）[11]。仅有两项观察性研究（发表于5篇文献[17-21]）符合早期诊断获益的纳入标准。一项高质量的回顾性观察研究，比较了1973—2005年甲状腺乳头状癌治疗组（n=35 663）和未治疗组患者（n=440）的生存率[16]。总的来说，与治疗组相比未治疗组患者20年生存率稍差（97% vs. 99%, P < 0.001）。但是这些研究没有调整潜在的混杂因素。另一项由日本主导的高质量的前瞻性研究报道两个独立队列（1993—2004年和2005—2013年）的乳头状微小癌的复发和生存率[18-21]。第一队列，1 055名患者选择接受即刻手术治疗而340人选择观察，大约随访6年后，观察组患者的32.1%接受了手术治疗，即刻手术组的2名患者死亡而观察组无患者死亡；第二队列，974名患者选择即刻手术治疗，1 179名患者选择了积极观察，大约随访4年后，8%积极观察组的患者选择了手术治疗，两组均没有出现远处转移和相关死亡。因为两个研究缺乏混杂因素的调整，所以不能确定早期即刻治疗与延迟治疗和非手术治疗相比，在改善甲状腺乳头状癌和微小癌患者预后方面是否存在差异。
国内学者周鑫等[22]采用秩和检验比较甲状腺癌患者性别、年龄、治疗方法等对患者生存质量等级高低的影响是否存在差异，结果显示：治疗方法（手术与非手术）对甲状腺癌生存质量等级的影响差异无统计学意义（χ2=-0.481, P=0.631）。积极的手术治疗并未显著改善甲状腺癌患者的生活质量。
5 筛查相关早期诊断和治疗的潜在危害
目前缺乏关于筛查危害的充分直接证据，但考虑甲状腺癌治疗危害的充足证据以及过度诊断和过度治疗可能会因人群筛查而大量出现的直接证据，USPSTF建议适当控制筛查和治疗的总体危害。
没有研究直接调查颈部触诊和超声甲状腺筛查的危害。总体来说，甲状腺癌筛查的危害证据非常有限，包括细针穿刺活检的危害（住院治疗，术后血肿，针道种植）[11, 23-24]。USPSTF发现了36项关于手术危害的高质量研究，32项关于永久甲状旁腺功能减退（低钙血症），28项关于永久性喉返神经麻痹（声带麻痹），2项关于手术死亡率，15项关于其他主要的手术危害。这些大多数为回顾性观察研究，仅3项为随机研究[14]。队列规模从76人到13 854人不等。
大量证据表明了外科治疗和放射性碘治疗的危害。永久性甲状旁腺功能减退的发生率差异较大（15个研究组），预计每100台甲状腺手术出现2~6例永久甲状旁腺功能减退，若伴淋巴结清扫术则发生率差异较大。永久性喉返神经麻痹的发生率差异较小（14个研究组），预计每100例手术（包括或不包括淋巴结清扫）出现1~2例。16项高质量的研究（n=94 823）证明了放射性碘清甲和治疗的潜在危害[14]。预计每年，每10 000人有12~13人出现继发性肿瘤[14, 25-26]，每100人有2.3~21人出现唾液腺损害（例如口干）[14, 27-32]。
6 甲状腺癌是否存在过度诊断
甲状腺癌具有惰性生长的生物学性质，即使发生了局部淋巴结转移，复发率和死亡率都极低。肿瘤学界将甲状腺癌发病率持续升高而死亡率却保持稳定的特殊现象定义为“过度诊断”[33]。
尽管没有筛查导致过度诊断的直接证据。生态和横截面数据显示甲状腺癌筛查导致甲状腺癌发病率增加，但甲状腺癌的死亡率并没有因此改变[10]。同样的情况也出现在我国[7, 9]。甲状腺癌过度诊断的最佳生态学证据来自韩国，他们从1999年开始建立了有组织的肿瘤筛查系统[34]。尽管这个系统并没有正式包括甲状腺癌筛查，但是临床医生经常只需要额外很少费用就可以提供超声的甲状腺癌筛查。2011年，甲状腺癌的诊断率是1993年的15倍，但甲状腺癌相关的死亡率却保持稳定。甲状腺癌的发病率与韩国成人接受甲状腺癌筛查的比例呈正相关[34]。
尸检研究为甲状腺癌过度诊断提供了另外的证据。2014年Lee等[35]总结了1969年至2005年关于尸检发现潜在甲状腺癌的15项研究。从8 619例甲状腺标本中，检出了989（11.5%）例甲状腺乳头状癌，其中大多数为微小癌（直径小于1 mm~3 mm）。
7 USPSTF的结论
USPSTF没有发现筛查获益和筛查危害的充分直接证据，但可以确定的是筛查和治疗的整体获益极小，而且应适度限制筛查和治疗的总体危害。另外发现了治疗危害的充分证据和基于人口筛查导致大量的过度诊断和过度治疗的间接证据。除了甲状腺罕见肿瘤，治疗和随访的预后没有明显差异。观察数据显示随着肿瘤筛查系统的引入，死亡率并没有改变。因而，USPSTF中等水平确定甲状腺癌筛查的净获益为阴性。
8 思考
国外的经验教训及我国的数据迫使中国学者思考：如何解决我国面临的甲状腺癌“过度诊断”和“过度治疗”的风险[3-4]。2016年《甲状腺微小乳头状癌诊断与治疗专家共识》指出：对于低危的甲状腺微小乳头状癌患者，严格选择指征并充分结合患者意愿，可采取密切观察的处理。这些并不符合我国“早发现，早诊断，早治疗”肿瘤防治的基本策略。不可否认国内外对于甲状腺癌治疗的态度趋向于谨慎和保守。肿瘤筛查是肿瘤防治策略“早发现”的重要环节，但是否推荐无症状人群行甲状腺癌筛查仍存在较大争议。我国甲状腺癌有自己的发病特点，国外的推荐指南未必完全适用于我国国情，见表 2。但甲状腺癌发病率的明显升高和超声普及带来的甲状腺手术量增加的趋势和国外基本一致，我们应积极进行相关研究，制定基于我国临床特点的甲状腺癌筛查建议，减少过度诊断和过度治疗所带来的危害。
表 2 主要医疗机构关于无症状人群甲状腺癌筛查的意见Table 2 Recommendation on screening for thyroid cancer in asymptomatic persons from major medical institutions
Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。作者贡献：陈奕孛：收集标本、实施实验、论文撰写苗 根：收集标本、标本前处理、数据整理王 文：设计实验、结果分析、论文修改丁翠玲、戚中田：设计实验、论文审校 -
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图 1 蛋白质及磷酸化蛋白质样本质控评估
Figure 1 Quality control evaluation of protein and phosphorylated protein samples
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图 4 差异蛋白功能KEGG富集分析
Figure 4 KEGG enrichment analysis of differential protein functions
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图 7 差异磷酸化蛋白功能GO富集分析
Figure 7 GO enrichment analysis of differential phosphorylated protein functions
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图 8 差异磷酸化蛋白功能KEGG富集分析
Figure 8 KEGG enrichment analysis of differential phosphorylated protein functions
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图 10 去本底蛋白修饰位点功能富集分析
Figure 10 Functional enrichment analysis of modified sites inbackground-removal proteins
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图 11 去本底蛋白修饰位点蛋白互作网络
Figure 11 Protein interaction network of modified sites in background-removal proteins
表 1 HCT116细胞敲除RAI16后差异表达显著的关键蛋白质
Table 1 Differentially expressed key proteins after RAI16 knockout in HCT116 cells
Gene name Product Regulation STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Up CYP24A1 1,25-dihydroxyvitamin D(3) 24-hydroxylase, mitochondrial Up ITGB1 Integrin beta-1 Down DAPK1 Death-associated protein kinase 1 Up FGFR2 Fibroblast growth factor receptor 2 Up SMAD3 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Up CDK6 Cyclin-dependent kinase 6 Down NOTCH1 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Down CDKN1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Up RAD51 DNA repair protein RAD51 homolog 1 Down 
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表 2 HCT116细胞敲除RAI16后差异表达显著的关键磷酸化蛋白质
Table 2 Differentially expressed key phosphorylated proteins after RAI16 knockout in HCT116 cells
Gene name Product Regulation CDK1 Cyclin-dependent kinase 1 Down SKP1 S-phase kinase-associated protein 1 Up ORC1 Origin recognition complex subunit 1 Up CDC20 Cell division cycle protein 20 homolog Down RB1 Retinoblastoma-associated protein Down PTTG1 Securin Down RBL1 Retinoblastoma-like protein 1 Down
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表 3 HCT116细胞敲除RAI16后差异表达显著的去本底蛋白修饰位点
Table 3 Differentially expressed key modified sites in background-removal proteins after RAI16 knockout in HCT116 cells
Gene name class Product NEGG description SKP1 Phospho-more up S-phase kinase-associated protein 1 Modification-dependent protein catabolic process ORC1 Phospho-more up Origin recognition complex subunit 1 DNA replication RBL1 Phospho-more down Retinoblastoma-like protein 1 Regulation of cell cycle RB1 Phospho-more down Retinoblastoma-associated protein Regulation of cell cycle CDK1 Phospho-more down Cyclin-dependent kinase 1 Cyclin-dependent protein serine/threonine kinase activity CDC6 Phospho-more down Cell division control protein 6 homolog DNA replication initiation MCM4 Phospho-more down DNA replication licensing factor MCM4 DNA replication initiation TFDP1 Phospho-more down Transcription factor Dp-1 Cell cycle CHD4 Phospho-more down Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4 Peripheral T cell tolerance induction BAD Phospho-more up Bcl2-associated agonist of cell death Positive regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway in response to osmotic stress SNW1 Phospho-more down SNW domain-containing protein 1 Generation of catalytic spliceosome for second transesterification step
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