Clinical Characteristics of Chronic Myeloid Leukemia Patients with Deletion and Non-deletion of ASS Gene on Derivative Chromosome 9
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摘要:目的
探讨慢性髓性白血病(CML)慢性期衍生9号染色体ASS基因缺失与非缺失患者的临床特征及疗效。
方法分析初始治疗方案为伊马替尼并采用BCR/ABL1/ASS1 3色融合探针检测ASS基因是否缺失的CML患者的临床资料,分为缺失组(n=27)和非缺失组(n=92),分析其临床特征、治疗效果及预后。
结果119例患者平均年龄37.22±12.72岁,缺失组和非缺失组患者的sokal评分差异有统计学意义(χ2=4.304, P=0.038),其他一般特征差异无统计学意义(P > 0.05)。缺失组的3个月完全细胞遗传学反应(CCyR)率及6个月CCyR率、BCR-ABLIS≤ 1%率均低于非缺失组(均P < 0.05)。随访中位数为35.0(3.0~60.0)个月,缺失组PFS低于非缺失组(χ2=4.293, P=0.038),两组OS比较差异无统计学意义(χ2=0.008, P=0.931)。
结论伊马替尼治疗的CML慢性期患者中ASS基因缺失导致治疗疗效不佳及预后不良,且更易出现疾病进展。
Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical characteristics of patients with chronic myeloid leukemia (CML) in chronic phase with deletion and non-deletion of the argininosuccinate synthesis gene (ASS gene) on the derivative chromosome 9.
MethodsThe clinical data of patients with CML initially treated with imatinib and BCR/ABL1/ASS1 3-color fusion probe to detect ASS gene deletion were analyzed. The patients were divided into deletion group (n=27) and non-deletion group (n=92). Clinical characteristics, treatment effects, and prognosis were analyzed.
ResultsThe average age of 119 patients was 37.22±12.72 years old. The sokal score differed between the deletion and non-deletion groups (χ2=4.304, P=0.038). No statistically significant difference in other general characteristics was found (P > 0.05). The 3-month CCyR rate, 6-month CCyR rate, and BCR-ABLIS≤ 1% rate in the deletion group were lower than those in the non-deletion group (P < 0.05). The median follow-up of 119 patients was 35.0 (3.0-60.0) months. The PFS in the deletion group was lower than that in the non-deletion group (χ2=4.293, P=0.038). Overall survival was not significantly different between the two groups (χ2=0.008, P=0.931).
ConclusionThe deletion of the ASS gene in patients with chronic CML is related to the poor efficacy of imatinib treatment, poor prognosis, and high risk of disease progression.
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0 引言
目前,化学治疗仍是三阴性乳腺癌的主要治疗方法之一,但是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性严重影响了治疗效果,化疗药物与肿瘤细胞的接触是诱导继发性耐药的主要原因[1]。由于阿霉素是乳腺癌化学方案的常用药物[2],本研究观察阿霉素对三阴性乳腺癌耐药性的诱导作用并探究其机制。
ATP结合盒(ABC)转运蛋白在耐药的发展中起着至关重要的作用。ATP结合盒亚家族G成员2(ATP-binding cassette, sub-family G member 2, ABCG2)能排出大量异质化合物,导致耐药,引起治疗抵抗[3]。细胞耐药性的产生及耐药蛋白的表达受多种转录因子的调控。有研究报道cMyc能够调控包括ABCG2在内的ABC转运蛋白的表达[4]。cMyc是一个多功能的转录因子,参与调节细胞对阿霉素的敏感度[5],而cMyc的表达受其上游基因Stat3的调控。Stat3在肿瘤组织中异常激活,引发其下游靶基因cMyc转录,从而使正常细胞转化为癌细胞,并增加肿瘤细胞的耐药性[6]。因此,本研究观察阿霉素对MDA-MB-468细胞耐药性的诱导作用并探讨Stat3-cMyc通路是否介导了耐药性的发生。
1 材料与方法
1.1 细胞株、试剂、仪器
人乳腺癌MDA-MB-468细胞株购自美国标准细胞库(American type culture collections, ATCC)。本研究实验剂和仪器包括:RPMI 1640培养基(Hyclone,美国)、青霉素/链霉素(索莱宝,北京,中国)、胎牛血清(四季青,杭州,中国)、阿霉素(索莱宝,北京,中国)、RIPA裂解液/苯甲基磺酰氟(索莱宝,北京,中国)、聚偏二氟乙烯膜(Millipore,Billerica,美国)、ABCG2抗体(Abcam,Cambridge,美国)、WP1066抑制剂(Selleckchem,上海,中国)和二甲基亚砜(索莱宝,北京,中国)等。
1.2 细胞培养
人乳腺癌MDA-MB-468细胞用含10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640在37℃、5%CO2培养箱中培养。以不同浓度的阿霉素(0、0.05、0.1和0.5 μmol/L)孵育细胞24 h,观察并筛选最适阿霉素浓度进行后续实验。
1.3 MTT法检测
细胞以3 000个/孔的密度接种至96孔板,然后分别加入终浓度为0、0.05、0.1和0.5 μmol/L的阿霉素。24 h后,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)继续培养4 h,吸弃培养液,每孔加150 μl DMSO溶液,振荡15 min后测定570 nm处的吸光度(OD570)。
1.4 细胞爬片及免疫荧光染色
将盖玻片置于24孔板孔底,分别将MDA-MB-468和MDA-MB-468/ADM细胞以1×104个/孔接种,待细胞爬满盖玻片后进行免疫荧光染色。用PBS轻轻冲洗后在4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗涤爬片3次,山羊血清封闭1 h。将细胞用ABCG2一抗在4℃冰箱中孵育、过夜。PBS洗涤后,用二抗于37℃温育1 h。PBS洗涤细胞,用DAPI染色10 min,再次洗涤3次后滴加荧光防淬灭剂,观察免疫荧光染色并拍照。
1.5 蛋白质印迹分析
抽提各组细胞的总蛋白,利用BCA法测定总蛋白浓度,以每个泳道20 μg浓度的蛋白样品上样,经SDS-PAGE电泳后,利用半干电转化法将蛋白转移至PVDF膜上,经过封闭、一抗(稀释倍数1:1 000)孵育、TBST洗脱、HRP标记的二抗(稀释倍数1:5 000)孵育、TBST再洗脱等步骤后,用增强化学发光法检测信号及X线片曝光,并且经定影显影处理,获得清晰条带。
1.6 统计学方法
运用SPSS13.0统计软件进行分析,所有结果采用(x±s)表示,组间均数的比较采用独立t检验(双侧),P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 持续低剂量阿霉素刺激诱导MDA-MB-468细胞产生耐药性
不同浓度阿霉素作用于MDA-MB-468细胞24 h后可见0.05 μmol/L与0.1 μmol/L浓度的阿霉素未引起细胞明显的损伤,大部分细胞生长良好。当浓度增加到0.5 μmol/L时,几乎所有细胞都受损,可见大量坏死细胞;MTT法测得在0.05 μmol/L、0.1 μmol/L及0.5 μmol/L浓度下阿霉素对MDA-MB-468细胞的抑制率分别为0.14、0.20、0.38,而且阿霉素对MDA-MB-468细胞的半数最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)为0.94 μmol/L(P=0.038)。综合以上结果,我们选用0.1 μmol/L的阿霉素继续进行后续研究。
用0.1 μmol/L的阿霉素持续刺激MDA-MB-468细胞4周后获得耐药细胞,命名为MDA-MB-468/ADM。MTT实验检测MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素敏感度,结果显示MDA-MB-468/ADM的EC50为5.2 μmol/L,较MDA-MB-468的EC50(0.94 μmol/L)显著升高(P=0.041),说明长期使用0.1 μmol/L的阿霉素后,MDA-MB-468细胞对阿霉素的敏感度显著下降,产生耐药,见图 1。
2.2 MDA-MB-468/ADM细胞中高表达耐药蛋白ABCG2
与正常MDA-MB-468细胞相比,MDA-MB-468/ADM细胞中代表ABCG2表达水平的红色荧光明显增多增强,见图 2A。Western blot检测结果也表明了MDA-MB-468/ADM细胞中ABCG2的高表达,见图 2B。提示用0.1 μmol/L阿霉素持续刺激后,三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药。
图 2 MDA-MB-468/ADM细胞中耐药蛋白ABCG2的表达Figure 2 Expression of drug resistance protein ABCG2 in MDA-MB-468/ADM cellsA: Immunofluorescence staining results showed the increased expression of ABCG2 (red) in MDA-MB-468/ADM cells, staining with DAPI (blue); B: Western blot analysis results showed high expression of ABCG2 in MDA-MB-468/ADM cells (n=3, *: P < 0.05)2.3 MDA-MB-468/ADM细胞高表达p-Stat3与cMyc
为探究MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药的机制,我们进一步检测了MDA-MB-468/ADM细胞中转录因子p-stat3与cMyc的表达水平,观察MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生是否与Stat3-cMyc途径有关。Western blot结果显示,MDA-MB-468/ADM中p-Stat3与cMyc的表达均明显升高,而两组细胞中总的Stat3表达水平未见显著变化。这些结果表明Stat3的激活和cMyc表达的增多可能参与了MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生,见图 3。
2.4 抑制Stat3活化可下调cMyc及ABCG2的表达
为进一步证明Stat3-cMyc途径在阿霉素诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性产生中的作用,我们用Stat3磷酸化的抑制剂WP1066抑制Stat3活化,观察转录因子cMyc的表达是否受到影响。结果显示WP1066(1.25 μmol/L)作用于MDA-MB-468/ADM细胞后,磷酸化的Stat3显著降低(P=0.014),同时cMyc表达水平明显下降(P=0.044)。另外WP1066处理后MDA-MB-468/ADM细胞耐药蛋白ABCG2的表达也显著减少(P=0.000)。这些结果进一步说明阿霉素通过Stat3-cMyc途径诱导了MDA-MB-468细胞耐药性的产生,而抑制Stat3的活化后,耐药蛋白表达减少,细胞的耐药性减弱,见图 4。
2.5 抑制Stat3活化增强了MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度
由于WP1066下调了耐药蛋白ABCG2的表达,因此我们进一步通过MTT法检测MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素敏感度的变化。结果显示,阿霉素对MDA-MB-468/ADM细胞的EC50为6.774 μmol/L,而在使用WP1066之后的EC50降低至1.29 μmol/L(P=0.000),这表明WP1066抑制Stat3的活化增强了MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度,见图 5。
3 讨论
目前肿瘤细胞的耐药性是临床治疗的难点与研究的热点,阐明肿瘤耐药的机制可以为肿瘤的治疗提供新的治疗方向和靶点。
本研究应用低剂量阿霉素持续诱导人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞,导致细胞产生耐药性,对阿霉素的敏感度显著下降,耐药蛋白ABCG2表达增高。为探究MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药的机制,本实验进一步检测了MDA-MB-468/ADM细胞中转录因子p-stat3与cMyc的表达水平,观察MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生与Stat3-cMyc途径有关。为进一步证明Stat3-cMyc途径在阿霉素诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性产生中的作用,实验用Stat3磷酸化的抑制剂WP1066抑制Stat3活化,发现转录因子cMyc的表达也受到影响。进一步的机制研究揭示了Stat3-cMyc通路在阿霉素诱导的耐药中具有重要作用。
文献报道,Stat3信号通路与肿瘤细胞对化疗的耐药性有关[7]。Stat3的激活可以帮助癌细胞逃避由药物引起的死亡,从而诱发耐药性。Yue等[8]证明了Stat3的过度活化可以促进顺铂耐药的卵巢癌进展,相反,如果抑制Stat3信号通路则会促进耐药性癌细胞的凋亡,增加癌细胞对各种药物的敏感度。Li等[9]研究也有相似的发现,抑制Stat3信号通路后人胃癌细胞的凋亡增强,耐药性减弱。那么Stat3在三阴性乳腺癌耐药性的产生中有何作用?文献报道,乳腺癌组织中Stat3的活化增强与乳腺癌的临床分期和侵袭转移密切相关[10]。多种致癌性细胞因子与细胞膜的相应受体结合后导致Stat3与酪氨酸磷酸化通道相偶联后被激活,激活后的Stat3可在核内与特异性DNA启动子相结合,调节cMyc、Oct4、Sox2等相关基因表达[11]。作为调节多种转录因子功能的重要枢纽,Stat3有望成为肿瘤基因治疗中的有效靶点。有研究表明,在肿瘤中cMyc的表达水平与耐药性有关[4, 12-13],cMyc能够调控ABC转运蛋白的表达水平,而ABCG2与肿瘤细胞的耐药性直接相关,但Stat3/cMyc在三阴性乳腺癌产生耐药性方面的影响及机制却未见报道。
本研究发现低浓度(0.1 μmol/L)阿霉素持续刺激使MDA-MB-468细胞对阿霉素的敏感度明显降低,MDA-MB-468/ADM细胞中p-Stat3和cMyc的表达较MDA-MB-468细胞显著增加,这些发现与上述文献中对Stat3和cMyc在肿瘤耐药性中的作用相一致。另外,刘丽等[6]在喉鳞癌细胞的研究中也揭示了Stat3-cMyc通路的重要作用,与本研究的结果相吻合。由此推测,MDA-MB-468/ADM对阿霉素耐药的机制很可能与Stat3的激活和p-Stat3介导的cMyc表达的增多有关。为进一步证明Stat3-cMyc通路在阿霉素诱导的乳腺癌耐药性中的关键作用,本实验应用WP1066抑制MDA-MB-468/ADM中Stat3的活化,发现随着p-Stat3的降低,cMyc和ABCG2的表达也相应下降,这与Granato等[14]证实抑制Stat3信号可下调cMyc的表达一致。再次MTT检测发现WP1066作用后MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度显著增强,这与Li等[9]研究结果一致。
总之,本实验结果表明阿霉素可以诱导Stat3活化,上调转录因子cMyc及耐药蛋白ABCG2的表达,促进了三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生。因此,抑制Stat3的表达与活化可有效逆转乳腺癌对阿霉素的耐药性,特异性靶向Stat3-cMyc途径联合化疗药物治疗有望成为一种有效治疗乳腺癌的新措施,改善乳腺癌患者的预后。
Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.作者贡献:高冠论、周璇:课题设计、资料分析、撰写论文许娜、魏婷:数据统计分析与修改核对刘晓力、李庆山:拟定写作思路、指导论文撰写与修改 -
表 1 ASS基因缺失组和非缺失组CML患者临床基线资料比较
Table 1 Comparison of clinical baseline date of patients with CML in ASS gene deletion and non-deletion groups
表 2 ASS基因缺失组和非缺失组CML患者各时点遗传学反应疗效比较
Table 2 Comparison of therapeutic effects of genetic responses among patients with CML in ASS gene deletion and nondeletion groups at each time point
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[1] Jabbour E, Kantarjian H. Chronic myeloid leukemia: 2020 update on diagnosis, therapy and monitoring[J]. Am J Hematol, 2020, 95(6): 691-709. doi: 10.1002/ajh.25792
[2] Chandran RK, Geetha N, Sakthivel KM, et al. Prognostic Implications of Derivative Chromosome 9 Deletions in Patients with Advanced-Stage Chronic Myelogenous Leukemia[J]. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 2018, 37(2): 117-126. doi: 10.1615/JEnvironPatholToxicolOncol.2018026023
[3] Asnafi AA, Deris Zayeri Z, Shahrabi S, et al. Chronic myeloid leukemia with complex karyotypes: Prognosis and therapeutic approaches[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(5): 5798-5806. doi: 10.1002/jcp.27505
[4] Li JY, Xu W, Wu W, et al. The negative prognostic impact of derivative 9 deletions in patients who received hydroxyurea treatment for chronic myelogenous leukemia in the chronic phase[J]. Onkologie, 2008, 31(11): 585-589.
[5] 中华医学会血液学分会. 中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2016年版)[J]. 中华血液学杂志, 2016, 37(8): 633-639. https://xuewen.cnki.net/CCND-YIYA201610190061.html Chinese Society of Hematology, Chinese Medical Association. The guidelines for diagnosis and treatment of chronic myelogenous leukemia in China (2016 edition)[J]. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2016, 37(8): 633-639. https://xuewen.cnki.net/CCND-YIYA201610190061.html
[6] Deininger MW, Shah NP, Altman JK, et al. Chronic Myeloid Leukemia, Version 2.2021, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2020, 18(10): 1385-1415. doi: 10.6004/jnccn.2020.0047
[7] Zhou T, Medeiros LJ, Hu S. Chronic Myeloid Leukemia: Beyond BCR-ABL1[J]. Curr Hematol Malig Rep, 2018, 13(6): 435-445. doi: 10.1007/s11899-018-0474-6
[8] Zhang H, Liu M, Wang X, et al. Genomic Copy Number Variants in CML Patients With the Philadelphia Chromosome (Ph+): AnUpdate[J]. Front Genet, 2021, 12: 697009. doi: 10.3389/fgene.2021.697009
[9] 张朕豪, 王艳芳, 王淼, 等. 应用三色双融合探针检测BCR-ABL融合基因及ASS1基因缺失[J]. 中国实验血液学杂志, 2020, 28(4): 1115-1122. doi: 10.19746/j.cnki.issn1009-2137.2020.04.006 Zhang ZH, Wang YF, Wang M, et al. [Detection of BCR/ABL Fusion Gene and ASS1 Gene Deletion by Using Tricolor Dual-fusion Probe[J]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 2020, 28(4): 1115-1122. doi: 10.19746/j.cnki.issn1009-2137.2020.04.006
[10] Fourouclas N, Campbell PJ, Bench AJ, et al. Size matters: the prognostic implications of large and small deletions of the derivative 9 chromosome in chronic myeloid leukemia[J]. Haematologica, 2006, 91(7): 952-955
[11] Egan D, Radich J. Making the diagnosis, the tools, and risk stratification: More than just BCR-ABL[J]. Best Pract Res Clin Haematol, 2016, 29(3): 252-263. doi: 10.1016/j.beha.2016.10.015
[12] Fernandes A, Shanmuganathan N, Branford S. Genomic Mechanisms Influencing Outcome in Chronic Myeloid Leukemia[J]. Cancers (Basel), 2022, 14(3): 620. doi: 10.3390/cancers14030620
[13] Hochhaus A, Baccarani M, Silver RT, et al. European leukemianet 2020 recommendations for treating chronic myeloid leukemia[J]. Leukemia, 2020, 34: 966-984. doi: 10.1038/s41375-020-0776-2
[14] Hochhaus A, Larson RA, Guilhot F, et al. Long-Term Outcomes of Imatinib Treatment for Chronic Myeloid Leukemia[J]. N Engl J Med, 2017, 376(10): 917-927. doi: 10.1056/NEJMoa1609324
[15] Gorusu M, Benn P, Li Z, et al. On the genesis and prognosis of variant translocations in chronic myeloid leukemia[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2007, 173(2): 97-106. doi: 10.1016/j.cancergencyto.2006.10.006
[16] 董洁, 李薇, 白晶, 等. 9号衍生染色体在慢性粒细胞白血病预后评估中的意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(2): 301-305. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-BQEB201602021.htm Dong J, Li W, Bai J, et al. Significance of derivative chromosome 9 in evaluation on prognosis of chronic myeloid leukemia[J]. Jilin Da Xue Xue Bao(Yi Xue Ban), 2016, 42(2): 301-305. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-BQEB201602021.htm
[17] Kim DH, Popradi G, Sriharsha L, et al. No significance of derivative chromosome 9 deletion on the clearance kinetics of BCR/ABL fusion transcripts, cytogenetic or molecular response, loss of response, or treatment failure to imatinib mesylate therapy for chronic myeloid leukemia[J]. Cancer, 2008, 113(4): 772-781. doi: 10.1002/cncr.23607
[18] Švabek ŽT, Josipović M, Horvat I, et al. The incidence of atypical patterns of BCR-ABL1 rearrangement and molecular-cytogenetic response to tyrosine kinase inhibitor therapy in newly diagnosed cases with chronic myeloid leukemia (CML)[J]. Blood Res, 2018, 53(2): 152-159. doi: 10.5045/br.2018.53.2.152
[19] Quintás-Cardama A, Kantarjian H, Shan J, et al. Prognostic impact of deletions of derivative chromosome 9 in patients with chronic myelogenous leukemia treated with nilotinib or dasatinib[J]. Cancer, 2011, 117(22): 5085-5093. doi: 10.1002/cncr.26147
[20] Bennour A, Ouahchi I, Ben Youssef Y, et al. Molecular cytogenetic study of derivative chromosome 9 deletion in chronic myeloid leukemia patients[J]. Med Oncol, 2012, 29(2): 1151-1160. doi: 10.1007/s12032-011-9918-8
[21] Jiang Y, Zhang J, Guo D, et al. Entire ABL1 Gene Deletion Without BCR/ABL1 Rearrangement in a Female Patient with B-Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia[J]. Onco Targets Ther, 2020, 13: 783-790. doi: 10.2147/OTT.S238336
[22] Bennour A, Sennana H, Laatiri MA, et al. Molecular cytogenetic characterization of variant Philadelphia translocations in chronic myeloid leukemia: genesis and deletion of derivative chromosome 9[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2009, 194(1): 30-37. doi: 10.1016/j.cancergencyto.2009.05.010
[23] Kreil S, Pfirrmann M, Haferlach C, et al. Heterogeneous prognostic impact of derivative chromosome 9 deletions in chronic myelogenous leukemia[J]. Blood, 2007, 110(4): 283-1290.
[24] 李珍, 张龑莉, 赵慧芳, 等. 伊马替尼联合三氧化二砷治疗伴有ASS基因缺失的Ph+慢性粒细胞白血病的临床研究[J]. 中国实用医刊, 2019, 46(11): 97-99. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HBZY201812008.htm Li Z, Zhang YL, Zhao HF, et al. Effects of imatinib combined arsenic trioxide on Ph+chronic myeloid leukemia patients lacking of ASS genes[J]. Zhongguo Shi Yong Yi Kan, 2019, 46(11): 97-99. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HBZY201812008.htm