0   引言

宫颈癌是女性生殖系统第四大最常见的恶性肿瘤^[1]，其治疗方式主要有手术和放疗，化疗广泛应用于与手术、放疗配合的综合治疗和晚期复发性宫颈癌的治疗^[2]。宫颈癌是免疫相关肿瘤，其发生发展及治疗过程中伴随着机体免疫功能的变化。手术及放化疗对机体免疫功能的影响尚存争议，传统观念认为，手术及放化疗在治疗宫颈癌的同时，会对机体免疫产生打击，具有免疫抑制性。然而，现代肿瘤免疫学认为放化疗发挥了“免疫佐剂”的作用，具有与免疫治疗相结合的潜力^[3]。外周血淋巴细胞（PBL）能一定程度上反映机体免疫功能，故本研究通过检测宫颈癌患者化疗尤其是新辅助化疗（NACT）以及手术前后PBL及其亚群的数量，分析宫颈癌患者机体免疫功能特征以及治疗过程中机体免疫功能的动态变化，以探讨化疗以及手术对宫颈癌患者机体免疫功能的影响。

1   资料与方法

1.1   临床资料

回顾性分析2018年12月—2021年12月于重庆医科大学附属第一医院妇科住院治疗的313例宫颈癌患者的机体免疫功能检测数据。纳入初次治疗前即获得机体免疫功能检测结果的宫颈癌患者（鳞癌、腺癌、腺鳞癌及其他特殊类型），收集其完整病历资料（患者基本信息：影像学、病理学报告、HPV检测结果、化疗方案、手术方式、机体免疫功能检测报告）；排除无明确病理学诊断、合并免疫系统疾病、有严重合并症（如治疗前有严重感染、休克、重要脏器功能衰竭）、合并其他来源恶性肿瘤的患者。根据宫颈癌诊断与治疗指南（第四版）^[2]，所有患者均通过宫颈活检术/锥切术或宫颈癌根治术获得了组织标本，最终的组织病理学诊断以重庆医科大学病理中心提供的病理报告为准。FIGO分期（2018版）由2名副主任及以上级别医师通过妇科查体、盆腹腔增强磁共振成像（MRI）或计算机断层扫描成像（CT）来确定；胸部高分辨率CT（HRCT）或正电子发射断层扫描成像（PET-CT）评估远处转移。

1.2   研究方法

所有患者均在治疗前、化疗1~4次后3周、手术后3~7天抽取清晨空腹血，重庆医科大学附属第一医院临床分子检测中心采用流式细胞仪技术测定患者的机体免疫功能，检测项目包含外周血总淋巴细胞、总T（CD3⁺）淋巴细胞、辅助/诱导T（CD3⁺CD4⁺）淋巴细胞、抑制/杀伤T（CD3⁺CD8⁺）淋巴细胞、双阳性T（CD3⁺CD4⁺CD8⁺）淋巴细胞、双阴性T（CD3⁺CD4^-CD8^-）淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞，CD3^-CD16/CD56⁺）、自然杀伤T细胞（NKT细胞，CD3⁺CD16/CD56⁺）的计数绝对值、CD4⁺/CD8⁺比值，检测结果录入患者住院电子病历系统中。治疗过程中，未能获得化疗后或手术后数据的患者仍然纳入基线数据分析。

1.3   统计学方法

采用SPSS26.0软件进行统计分析。因数据为非正态分布，其特征描述采用中位数及四分位数。将宫颈癌患者以年龄、FIGO分期、病理学类型、组织学分级、有无HPV感染分组，针对其治疗前外周血淋巴细胞计数绝对值的影响因素进行Kruskal-Wallis检验，使用Bonferroni检验比较组间差异；同一宫颈癌患者治疗前后不同时间点的数据采用Wilcoxon符号秩检验；化疗有效患者和化疗无效患者间化疗前的数据对比采用Mann-Whitney U检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   患者基本临床特征

本研究共纳入宫颈癌患者313例，按照患者年龄、有无HPV感染、FIGO分期、病理学类型、组织学分级分组，每组病例数见表 1。可见宫颈癌患者主要集中在35~55岁，绝大多数伴有HPV感染，在确诊时大多为Ⅰ~Ⅱ期，病理学类型以鳞癌为主，组织学分级多为中低分化到中分化。

表  1  313例宫颈癌患者临床特征

Table  1  Clinical characteristics of 313 patients with cervical cancer

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2.2   治疗前机体免疫功能的影响因素

本研究发现宫颈癌患者治疗前外周血淋巴细胞计数绝对值受年龄（P < 0.001）、病理分型（P=0.023）影响，见表 2~3。在对年龄进行的单因素分析中，发现35~55岁的患者在NK细胞绝对值上低于 > 55岁的患者（adj.P < 0.001），见表 2。在对病理分型进行单因素分析中发现，鳞癌（adj.P=0.013）和腺癌（adj.P=0.033）两种类型的患者CD4⁺T淋巴细胞绝对值高于神经内分泌癌患者，见表 3。本研究未发现FIGO分期、组织学分级、HPV感染对宫颈癌患者治疗前机体免疫功能有影响。

表  2  宫颈癌患者不同年龄亚组间NK细胞的差异

Table  2  Comparison of NK cell in patients of different age subgroups

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表  3  宫颈癌患者不同病理类型间CD4⁺T淋巴细胞的差异

Table  3  Comparison of CD4⁺ T lymphocyte in patients with different pathological types

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2.3   化疗对宫颈癌患者机体免疫功能的影响

我们检测了接受新辅助化疗或全程放化疗的患者化疗后的机体免疫功能，对复查时已行放疗的患者不纳入本次分析。共获得了75例患者辅助化疗结束3周后的机体免疫功能检测数据，其中随机给予改良剂量密度方案（D1, 8方案）的患者36例，随机给予传统3周化疗方案（D21方案）的患者39例。两组患者按紫杉醇175 mg/m²+顺铂90 mg/m²或奈达铂100 mg/m²计算药物剂量（TP方案），均通过静脉输注化疗药物，其中D1, 8方案组患者将紫杉醇及铂类药物在化疗周期第1天、第8天分别给予50%剂量，第22天、第29天以同样方式进行下一周期；D21方案组患者在化疗周期第1天给予100%剂量，第22天进行下一周期。

通过对比同一宫颈癌患者化疗前后的数据，发现宫颈癌患者化疗后整体B淋巴细胞绝对值均下降（P=0.012），T淋巴细胞及NK细胞未发现差异有统计学意义，见表 4；另对接受两种不同化疗方案的患者进行亚组分析时发现，D1, 8方案组患者化疗后总淋巴细胞（P=0.017）、CD3⁺淋巴细胞（P=0.046）、CD8⁺T淋巴细胞（P=0.021）、双阴性T淋巴细胞（P=0.037）、B淋巴细胞（P=0.009）、NK细胞（P=0.041）绝对值较化疗前均下降，见表 5，而D21方案组患者化疗后CD3⁺淋巴细胞（P=0.024）、CD4⁺T淋巴细胞（P=0.003）绝对值较化疗前升高，见表 6。

表  4  TP方案化疗前后宫颈癌患者机体免疫功能对比(n=75)

Table  4  Comparison of system immune function before and after TP regimen chemotherapy (n=75)

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表  5  TP(D1, 8)方案化疗前后机体免疫功能对比(n=36)

Table  5  Comparison of system immune function before and after chemotherapy with TP D1, 8 regimen (n=36)

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表  6  TP(D21)方案化疗前后机体免疫功能对比(n=39)

Table  6  Comparison of system immune function before and after chemotherapy with TP D21 regimen (n=39)

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2.4   手术对宫颈癌患者机体免疫功能的影响

我们检测了接受宫颈癌根治术患者术后的机体免疫功能，共获得104例患者术后3~7天的机体免疫功能检测数据，其中随机给予开腹术式的有36例，随机给予腹腔镜术式的有68例。我们对术前已行NACT的患者将化疗后的机体免疫功能作为术前数据与术后数据进行对比，结果显示，宫颈癌患者术后机体免疫功能整体呈显著下降趋势（P < 0.001），见表 7。另对接受两种不同手术路径的患者进行亚组分析时发现，开腹组术后各T淋巴细胞（P < 0.001）、NK细胞（P < 0.001）较术前显著下降，见表 8，而腹腔镜组术后各T淋巴细胞（P < 0.001）、B淋巴细胞（P < 0.001）、NK细胞（P=0.001）、CD4⁺/CD8⁺比值（P=0.001）较术前均显著下降，见表 9。

表  7  手术前后机体免疫功能对比(n=104)

Table  7  Comparison of system immune function before and after operation (n=104)

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表  8  开腹手术前后机体免疫功能对比(n=36)

Table  8  Comparison of system immune function before and after open surgery (n=36)

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表  9  腹腔镜手术前后机体免疫功能对比(n=68)

Table  9  Comparison of system immune function before and after laparoscopic surgery (n=68)

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3   讨论

浸润性宫颈癌的生存率为67%^[4]，晚期及复发性宫颈癌的治疗仍是一个巨大的挑战。人们普遍认为，高危型HPV持续性感染是宫颈癌的主要危险因素，而局部免疫反应被认为是HPV感染后宫颈癌变的关键因素^[5]。一项研究^[6]表明，HPV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）主要存在于患有宫颈高级别病变或侵袭性宫颈癌的妇女中。因此，宫颈癌是免疫相关性肿瘤，对其治疗过程中进行动态机体免疫功能检测，不仅可以更全面地评估治疗效果、疾病预后等，还可能为寻找最佳免疫治疗时机、制定更好的治疗方案提供帮助。

恶性肿瘤患者的免疫状态常表现为免疫细胞数量下降及功能抑制，贡鸣等^[7]发现宫颈癌患者T淋巴细胞下降幅度大于其他恶性肿瘤患者，提示子宫颈癌患者更应该监测免疫功能。机体免疫功能受多种因素影响，淋巴细胞水平与宫颈癌患者自身病理特征有相关性。王静等^[8]的研究发现，宫颈癌患者的临床分期高、分化程度低、淋巴结阳性者的外周血CD4⁺T细胞、CD4⁺/CD8⁺比值明显更高，而CD8⁺T细胞则明显更低。本研究发现宫颈癌患者的年龄、病理分型会对机体免疫造成影响。这可能与宫颈癌在流行病学上的高发年龄段相关^[4]，也可能与高龄患者自身免疫功能下降，单个细胞溶解能力下降而出现的NK细胞代偿性增多有关^[9]；且宫颈癌肿瘤细胞通过抑制NK细胞激活和增殖来实现免疫逃逸^[10]。值得注意的是宫颈神经内分泌癌（neuroendocrine cervix carcinoma，NECC）患者的CD4⁺T淋巴细胞绝对值明显低于鳞癌及腺癌患者。NECC是一种罕见类型，在所有宫颈癌中所占比例不到5%^[11]，其恶性程度高，易远处转移及复发，传统治疗疗效甚微。一项日本的研究^[11]尝试性探索了免疫细胞疗法在NECC患者中的疗效，与既往运用化疗的研究相比，该研究中接受免疫细胞治疗的患者中位生存期更长。尽管免疫细胞疗法抗NECC的机制尚不明确，但其仍不失为一种具有潜力的治疗方式。本研究虽只收集到7例NECC患者治疗前的机体免疫数据，但发现相较于其他类型尤其是鳞癌和腺癌这两种最常见的宫颈癌类型，NECC患者的机体免疫功能显著下降，这或许能为免疫治疗在NECC患者中的应用提供方向。

顺铂和紫杉醇是宫颈癌的一线化疗药物，除了具有细胞毒性可直接杀死肿瘤细胞外，还可增强肿瘤细胞的抗原性、诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡（ICD）等^[12]。Hanahan等^[13]在2000年提出节拍化疗，Van等^[14]在2002年最早提出剂量密度化疗方案较传统3周化疗方案有多方面优势，这也是本研究中改良剂量密度化疗（D1, 8方案）的依据。不论是节拍化疗还是剂量密度化疗，都是通过降低单次给药剂量、缩短化疗间歇期，不改变化疗总剂量甚至高于常规最大耐受剂量（MTD）的方式以求更好的疗效、更低的毒副作用。一些动物试验结果表明^[15-16]，顺铂和紫杉醇的剂量以及给药方式同样影响着机体免疫功能。Zhu等^[15]对比了使用节拍化疗和常规MTD的紫杉醇治疗Lewis肺癌模型小鼠，结果显示使用节拍化疗的紫杉醇后，小鼠脾脏和肿瘤中的DC百分比及CD80和CD86共刺激分子表达增加，而使用常规MTD的紫杉醇则得到了相反的结果。Tsai等^[16]发现使用节律性顺铂治疗宫颈癌模型小鼠，肿瘤细胞的MHC-I类分子表达、CTL诱导和短期肿瘤发生率均优于中剂量和高剂量顺铂治疗。本研究发现，D1, 8方案化疗后外周血中总淋巴细胞、CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞数量下降；D21方案化疗后外周血中CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞数量上升，而CD4⁺T细胞包含Treg等免疫抑制细胞，但由于缺乏化疗前后CD4⁺T细胞亚群的数据，难以鉴别CD4⁺T细胞数量的上升到底是抗肿瘤免疫的激活还是免疫抑制的进一步恶化，亦或是机体自我保护形成免疫耐受引起。除此之外，D1, 8方案患者的无药间歇期较D21方案患者短1周，可能是造成两种化疗方案结果差异的原因，提示相对于化疗剂量，或许化疗频率对机体免疫功能的影响更为显著。故今后需开展相应的临床研究加以验证，以求为宫颈癌患者找到更好的化疗方案。

另一方面，关于手术对恶性肿瘤患者机体免疫功能的影响尚有争议，有观点^[17]认为，手术通过减轻肿瘤负荷，可提高机体对残余肿瘤的免疫效能。而另有证据^[18]表明，手术不仅会引起T淋巴细胞数量的减少和功能受损，还会导致抑制免疫的Treg细胞和促进免疫的Th细胞和CTL细胞之间的失衡；此外，NK细胞的数量和功能也会受到手术影响，而其影响与结直肠癌、乳腺癌、头颈部癌和肺癌患者的死亡和复发的风险增加有关。Lee等^[19]研究发现，在早期宫颈癌患者中，PBL在术后第3天较术后第1天有所升高，但整体来看仍低于术前水平，此外，术后第3天PBL较术前升高超过100个/微升的患者，其无病生存期（DFS）明显长于术后第3天PBL下降或较术前升高低于100个/微升的患者。陈欣等^[17]的研究则发现在早期宫颈癌患者中，PBL在术后第7天较术后第3天有所升高，但仍低于术前水平，而术后第3天及第7天PBL与患者的DFS无关。本研究发现接受手术治疗的患者在术后1周内出现机体免疫功能的显著下降，说明手术后短时间内免疫系统受到的打击不能恢复。因此机体免疫功能将在术后多长时间恢复，是否能恢复至术前水平，以及其与疾病预后的关系仍是需要探讨的内容。此外，近年来腹腔镜手术在宫颈癌治疗中的应用备受争议。国外学者认为，导致腹腔镜广泛子宫切除术（RH）生存劣势的主要因素可能包括举宫器的使用、阴道离断方式、CO₂气腹、无瘤原则不彻底等^[20]。我们发现开腹手术和腹腔镜手术对机体免疫的影响存在显著差异，腹腔镜手术对T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞均有抑制，在开腹手术组中未发现相同程度的抑制。而机体免疫水平与宫颈癌预后相关，因此我们有理由怀疑除了上述手术操作差异可能对宫颈癌预后造成影响外，不同手术路径还可能通过影响机体免疫功能进一步影响疾病预后，故今后需开展更多相应的临床研究来探讨不同手术方式与机体免疫功能及疾病预后的相关性，以求为宫颈癌患者开展更合适的手术方式。

综上所述，外周血淋巴细胞检测作为一种快捷、易获得的免疫功能检测技术在临床工作中的应用越来越广泛。外周血淋巴细胞能一定程度上反应机体免疫水平，本研究通过外周血淋巴细胞检测宫颈癌、宫颈癌前病变、子宫良性肿瘤患者的机体免疫功能，以此探讨宫颈癌患者机体免疫功能的特点。本研究发现宫颈癌患者在化疗及手术前后出现机体免疫功能的变化，且不同化疗方案、不同手术路径对机体免疫功能具有不同的影响，而近期文献报道中鲜有此类对比研究。另由于本研究随访时间较短，未对机体免疫功能与预后的相关性进行分析，这在今后的研究中可以继续推进。