0   引言

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常见的癌症，全球每年约有70万人死于CRC^[1]。多数患者被发现时已处于晚期转移阶段。晚期CRC患者5年生存率仅为13.5%^[2]。如果不进行治疗，生存期通常为6~12个月^[3]。目前，晚期转移性CRC标准治疗方法包括全身化疗、分子靶向治疗和手术治疗。其中，全身化疗仍是治疗晚期转移性CRC的最主要方法，但化疗的不良反应大且有耐药现象的发生。近年来，免疫治疗领域取得了快速发展，免疫检查点抑制剂（immune checkpoints inhibitors, ICIs），包括程序性死亡受体1（programmed cell death-1, PD-1）/程序性死亡-配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）抑制剂及抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）等具有代表意义的免疫治疗药物越来越多被应用于临床。免疫治疗是现阶段抗肿瘤治疗的热点，ICIs治疗CRC正处于探索阶段，尚缺乏有效的疗效预测生物标志物。在肿瘤免疫治疗的应答中，肠道菌群（gut microbiome）被证实有一定的调节作用，部分细菌可通过免疫系统或机体代谢功能来影响ICIs的疗效。本文将围绕免疫检查点抑制剂、肠道菌群与CRC之间的关联，肠道菌群如何影响免疫检查点抑制剂治疗CRC的疗效，及通过干预影响肠道菌群进而提升ICIs疗效等方面进行综述。

1   免疫检查点抑制剂

1.1   免疫检查点抑制剂

PD-1又称CD729，是一种共抑制T细胞受体（TCR），在肿瘤微环境（tumor microenviro-nment, TME）中通过与其同源配体结合发挥作用^[4]。它在T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞（dendritic cells, DCs）和自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）等细胞中表达^[5]。PD-1含有288个氨基酸跨膜蛋白，由细胞内结构域、跨膜结构域和免疫球蛋白超家族结构域组成。其中，胞内结构域包含两个基于酪氨酸免疫受体，一个活化基序和一个抑制基序，负责信号的转导。PD-L1是PD-1的主要配体，又称B7-H1、CD274，是B7配体家族的1型跨膜糖蛋白，可表达于T细胞、B细胞、单核细胞和某些非造血干细胞^[6]。PD-1在正常组织中表达可以保护正常组织免受细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte）的攻击，进而预防自身免疫性疾病的发生发展^[7]。然而，当肿瘤细胞识别到T细胞上的PD-1时，肿瘤细胞会上调PD-1的配体PD-L1的表达。PD-L1与PD-1随之相互结合，促使细胞内酪氨酸的抑制和转换基序发生磷酸化，磷酸化后的酪氨酸基序与SHP-1和SHP-2结合，降低了T细胞分化的作用，分化变差的T细胞在TME内发出免疫抑制信号^[8-9]。PD-1受体被信号激活后，通过负反馈途径使TCR/BCR受到抑制，减少了免疫细胞因子的产生。此外，它还会损害B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和B细胞淋巴瘤-x_L（Bcl-x_L）等抗凋亡蛋白产生。PD-1的过度表达最终导致T细胞衰竭，减少干扰素γ（IFN-γ）的产生，导致细胞毒性增加^[10-11]。因此，PD-1与PD-L1之间的相互作用是被各种恶性肿瘤利用的免疫逃逸机制，是大多数恶性肿瘤预后不良的标志物。

免疫治疗意义在于逆转肿瘤免疫抑制并激活抗肿瘤反应^[12]。抑制PD-1/PD-L1的功能有助于恢复T细胞功能，其关键是阻断PD-1/PD-L1通路的抗体^[13]。免疫检查点抑制剂主要以PD-1和CTLA-4途径，通过阻断PD-1和CTLA-4与其配体的结合，T细胞被活化和增殖，导致T细胞介导的肿瘤T细胞浸润，最终抑制肿瘤^[14]。

1.2   免疫检查点抑制剂的临床应用

研究证实，晚期CRC中表现为错配修复缺陷/高度微卫星不稳定（dMMR/MSI-H）状态的患者对ICIs更敏感，具有较为客观及持续的临床反应，但此类状态患者仅占所有结直肠癌患者的3%~6%^[15]。目前，仅Pembrolizumab、Nivolumab以及Nivolumab联合Ipilimumab三种免疫检查点抑制剂被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于进展的dMMR/MSI-H转移性CRC病例。

Overman等^[16]的一项多中心、非随机的Ⅱ期临床试验NCT02060188，入组74例患者中，大多数（54%）曾接受过3线以上的治疗方案。患者每2周接受3 mg/kg的Nivolumab治疗，客观缓解率为31%，69%的患者疾病期控制超过12周，12个月总生存率为73%。此外，他们发起的另一项临床试验NCT02060188^[17]，入组119例患者，其中76%的患者经2线标准治疗失败后，接受Nivolumab 3 mg/kg联合Ipilimumab 1 mg/kg方案治疗，每3周一次，连续4次，此后行Nivolumab 3 mg/kg治疗，每2周一次，结果显示，客观缓解率为55%，12周疾病控制率达80%，12个月无进展生存率为71%，32%的患者发生3~4级不良反应，均可控。研究证实Nivolumab和Nivolumab联合Ipilimumab治疗方案均显示出较好的有效性，且安全性可控。Le等^[18]的一项PembrolizumabⅡ期开放性临床试验NCT02460198，入组124例接受氟嘧啶类、奥沙利铂和伊利替康治疗失败的进展期转移性dMMR/MSI-H状态CRC患者，其中61例为2线标准治疗失败者（A组），63例为1线标准治疗失败者（B组），予Pembrolizumab 200 mg治疗，每3周一次，最长维持2年，至疾病进展或无法耐受而停药。结果显示，A组随访31个月，B组随访24个月，客观缓解率均为33%，此时，两组中位反应时间均未达到。该研究证实了Pembrolizumab的有效性。目前，研究者仍在继续观察ICIs治疗转移性CRC的有效性及安全性，Andre等发起了一项有关Pembrolizumab的开放性Ⅲ期临床试验NCT02563002^[19]，将307例从未接受过治疗的转移性dMMR/MSI-H状态CRC患者随机平均分为两组，一组为每3周接受剂量为200 mg Pembrolizumab的治疗方案，另一组方案为每2周接受基于5-Fu（联合或不联合贝伐单抗或西妥昔单抗）的化疗。结果显示，Pembrolizumab方案的PFS优于5-Fu化疗方案（16.5月vs. 8.2月）。随访24个月后，Pembrolizumab方案组仍有83%的患者存在持续性反应，而5-Fu化疗组仅有35%的患者存在持续性反应。此外，Pembrolizumab方案3级以上不良反应发生率为22%，明显低于5-Fu化疗组（66%）。Andre等^[20]另一项临床试验NCT02563002，主要是针对Pembrolizumab单药治疗未接受过其他治疗的转移性dMMR/MSI-H CRC患者，与化疗组相比Pembrolizumab治疗组患者的健康相关生命质量有所改善。

到目前为止，只有PD-1抑制剂和CTLA-4抗体被批准应用于临床，因此，仍需要更多的临床试验进一步探索CRC患者能否在ICIs中获益，及ICIs使用时的安全性是否可控。

2   肠道菌群对免疫检查点抑制剂治疗结肠癌疗效的影响

2.1   肠道菌群与结直肠癌的关系

肠道菌群是存在于人体内的正常微生物群体。肠道菌群失调将导致肠道微生物群组成紊乱，进一步改变机体的生理功能，导致各种疾病^[21]。肠道菌群被认为与CRC发生、进展和转移有关。已有研究证实了牛链球菌、脆弱拟杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌等在CRC的发生中起促进作用^[22-23]。Yang等^[24]发现具核梭杆菌通过激活Toll样受体（toll-like receptor, TLR）将髓样分化因子的信号转导至核因子κB（NFκB），过度活跃的NFκB与miR21的启动子结合并增加其转录水平，上调miR21的表达，促进了小鼠CRC细胞增殖和肿瘤进展。而脆弱拟杆菌则是通过产生肠毒素进而刺激促炎因子IL-18的产生，诱发炎性反应。此外，其还可清除钙黏蛋白E（E-cadherin）干扰上皮稳态，促进结肠上皮的增生，最终导致CRC的发生^[25]。不同的菌群促发结直肠癌的机制存在差别，但都说明了机体的肠道微生态稳态被破坏是CRC发生发展的原因之一，肠道菌群也可能在CRC治疗中参与某些反应，影响治疗的结局。

2.2   肠道菌群对免疫检查点抑制剂治疗结直肠癌疗效的影响

CRC患者肠道菌群明显紊乱，其主要特点是菌群丰度和多样性改变^[26]。肠道菌群与CRC预后相关联，肠道菌群能否作为有效的预测性生物标志物及提升ICIs治疗的有效性成为研究者攻克的方向。Zhang等^[27]对PD-1抑制剂治疗CRC的效果是否受肠道菌群的影响进行了证实，该研究使用广谱抗生素耗竭小鼠肠道内源性菌群，结果导致PD-1抑制剂对肿瘤的抑制效果降低，表明PD-1抑制剂控制小鼠肿瘤生长的效果很大程度上依赖于肠道菌群的多样性。在此之后，该研究者又鉴定出在肿瘤免疫治疗反应良好的小鼠中乳杆菌显著增加。于是，他们将通过筛选分离出的副乳杆菌株作用到肠道菌群缺乏的小鼠中，发现小鼠的抗PD-1治疗仍保持了控制肿瘤生长的效果，且主要器官中没有发现形态或病理性损害。其机制可能是副乳杆菌通过诱导肿瘤细胞表达趋化因子CXCL10，进而促进CD8+T细胞向瘤床的募集^[28]。一项招募了74例接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的晚期消化道肿瘤患者的研究，对免疫治疗期间入组患者的粪便进行了测序，发现不同消化道肿瘤类型中真细菌、乳杆菌和链球菌与PD-1/PD-L1抑制剂的治疗反应呈正相关。除上述三种菌群外，与CRC免疫治疗获益相关的菌群还包括蓝绿藻菌、毛螺菌、瘤胃菌和小杆菌，而拟杆菌、粪球菌等在治疗反应差的患者肠道中富集^[29]。另有研究表明，PD-1抑制剂的较好疗效与高丰度的普雷沃菌属、狄氏副拟杆菌、嗜黏蛋白阿克曼菌等有关，而高丰度的拟杆菌属可能是PD-1抑制剂治疗CRC无效的原因之一^[30]。Xu等^[31]认为肠道菌群通过改变代谢水平使PD-1抑制剂治疗效果不同，如嗜黏蛋白阿克曼菌通过影响甘油磷脂合成代谢来维持PD-1抗体的功效，进而增强抗肿瘤反应。而拟杆菌则会增加慢性炎性反应，从而导致免疫功能受损。Yoon等^[32]观察到，与单独接受PD-1抑制剂相比，PD-1抑制剂联合短双歧杆菌显著提高了小鼠CD8+T细胞水平和CD8+/Treg比值，且干扰素-γ和白介素IL-2（IL-2）的表达升高更多，由此证明，短双歧杆菌不仅可通过增强淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫来体现抗肿瘤作用，还可依赖肠道-全身-肿瘤途径调节细胞因子以抵抗肿瘤。Mager等^[33]发现假长双歧杆菌、约氏乳杆菌、欧陆森氏菌3种细菌可提高ICIs对小鼠CRC模型的疗效，其中，假长双歧杆菌通过产生代谢产物肌苷增强免疫治疗反应，这种作用依赖于T细胞中特异性的腺苷A2A受体（A2AR）信号通路促进辅助性T细胞1（Th1）活化与免疫治疗共同产生效力。ICIs治疗结直肠癌患者无效通常是由于T细胞对肿瘤的不良渗透所致^[34]。Montalban-Arques等^[35]对T细胞相关肿瘤免疫进行了研究，观察发现增加了经四种梭状芽胞杆菌混合物（clostridiales strains, CC4）灌胃的CRC模型小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞向肿瘤组织的渗透，CC4单独或其与抗PD-1联合治疗清除了几乎所有肿瘤细胞，研究者推测，PD-1抑制剂与CC4相结合的治疗方法可能会对CRC的治疗产生协同效应，因此，梭状芽胞杆菌可能与CRC免疫治疗取得较好疗效存在相关性。

2.3   干预肠道菌群对免疫检查点抑制剂治疗结直肠癌疗效的影响

有研究者从健康人体中分离出11株能在肠道中诱导产生干扰素γ、CD8+T细胞的细菌菌株，发现它们能增强对单核细胞增生性李斯特菌的抵抗力，联合ICIs能有效地抑制肿瘤生长^[36]。Song等^[37]使用多粘菌素B（PMB）清除了肠道中的革兰氏阴性菌，改善了免疫抑制微环境，增加了肿瘤内T细胞的浸润，进而提升了CRC免疫治疗水平。基于肠道中革兰氏阴性菌产物内毒素与PD-1抑制剂治疗低反应相关，该团队还进行了另一项研究，他们将设计的脂多糖（LPS）（内毒素的主要成分）靶向融合蛋白装入纳米捕获系统中，阻断了肿瘤内部的LPS，成功抵抗了CRC的免疫抑制微环境，增强了PD-L1抑制剂的治疗作用，甚至还减少了CRC肝转移。Zhang等^[27]研究发现，果胶可改善肠道菌群失衡，逆转CRC患者肠道菌群多样性的降低。在果胶联合PD-1抑制剂治疗中，除了可直接促进T细胞向TME的渗透，诱导CD8+T细胞依赖的抗肿瘤反应外，瘤胃菌、霍尔德曼氏菌、栖粪杆菌等能产生免疫调节单链脂肪酸的细菌也增多，进一步促进了T细胞向肿瘤内的渗透。此外，中医药联合PD-1抑制剂也能通过肠道菌群对CRC患者疗效产生一定影响，Lv等^[38]报道了使用中药葛根芩连汤联合PD-1抑制剂治疗MSS型CRC的疗效，研究发现，葛根芩连汤联合PD-1抑制剂使用后，进行肠道菌群分析显示酸化拟杆菌含量增加。酸化拟杆菌是肠道一种有益的细菌，它通过调节代谢产物，增强机体的免疫能力。该研究也进一步证实，葛根芩连汤联合PD-1抑制剂通过下调PD-1表达，提高白介素-2（IL-2）水平，恢复T细胞功能，对免疫治疗获得较好疗效有一定作用。

欲改善对ICIs不敏感患者的疗效，研究者们正利用不同的方式对微生物群进行干预，包括粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）及摄入益生元、益生菌、噬菌体活菌等。经FMT将健康人体的整个肠道菌群移植到患者的肠道内，以完全重建和正常化肠道菌群的结构和功能，改变了难治性癌症患者肠道菌群的多样性，进而有可能提高ICIs的疗效^[39]。补充特定的益生菌或益生元，或通过窄谱抗生素对不利的菌群进行预防，也可能成为CRC免疫治疗为患者带来获益结局的有效方式。

3   肠道菌群对免疫检查点抑制剂治疗其他恶性肿瘤疗效的影响

免疫治疗已被证实在肾细胞癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤及尿路上皮细胞癌中取得了较好的疗效。Routy等^[40]将对ICIs敏感的上皮细胞癌患者的粪便通过FMT到无菌或使用抗生素的小鼠中，结果显示，经FMT的小鼠改善了PD-1抑制剂的抗肿瘤疗效，且该治疗反应与嗜黏蛋白阿克曼菌的相对丰度相关。嗜黏蛋白阿克曼菌主要通过增加CCR9+CXCR3+CD4+T淋巴细胞向小鼠瘤床募集，以白介素-12（IL-12）依赖的方式恢复抗PD-1治疗的疗效。Matson等^[41]发现转移性黑色素瘤中假长双歧杆菌、产气柯林斯菌和粪肠球菌丰度较高的患者抗PD-1免疫治疗效果好。Vétizou等^[42]认为CTLA-4阻断的抗肿瘤作用依赖于不同种类的拟杆菌属，并证实针对多形拟杆菌和脆弱拟杆菌与CTLA-4阻断治疗黑色素瘤的较好疗效有关。Oster等^[43]发现幽门螺杆菌阳性与PD-1抑制剂治疗非小细胞肺癌（NSCLC）患者生存率降低相关，其中幽门螺杆菌阳性患者中位生存期仅6.7个月，而阴性患者为15.4个月（P=0.001）。此外，该项研究中另一队列结果显示幽门螺杆菌阳性与接受抗PD-1治疗NSCLC患者无进展生存率显著降低有关。Mao等^[44]一项关于肝胆管癌患者肠道菌群与PD-1抑制剂疗效的研究证实，随着治疗的进行，对PD-1抑制剂反应差的患者菌群多样性有所降低，这一结果支持了肠道菌群可能成为预测免疫治疗反应的有效生物标志物，此外，该研究还发现，PD-1抑制剂反应良好组中类杆菌的相对丰度较高，而PD-1抑制剂不敏感组变形杆菌的相对丰度较高。

4   展望

微生物成分的多样性可能会影响PD-1抑制剂免疫治疗的效果，研究者正在寻找适合免疫治疗的肠道菌群状态。关于肠道菌群对免疫治疗的影响，不同研究之间也仍有不一样的发现。因此，需进一步进行包括大队列研究和临床试验等，以评估肠道菌群对ICIs有效性的影响。目前，CRC所获批的ICIs仅针对dMMR/MSI-H状态的CRC患者，且免疫治疗对其他状态下CRC疗效等尚未明确，未来还有待进一步研究。现阶段针对CRC免疫治疗预测性生物标志物的研究仍较少，肿瘤突变负荷、新抗原负荷、肿瘤浸润性淋巴细胞、免疫球蛋白等是目前研究发现可能具有较好前景的生物标志物，肠道菌群也正在成为影响肿瘤免疫治疗结果的关键调控因素，不仅是因为肠道菌群与CRC联系紧密，且菌群测序技术已相对成熟，因此，肠道菌群也有望成为CRC免疫治疗的疗效预测性生物标志物。