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摘要:目的
探讨miR-581对卵巢癌SKOV3细胞自噬的影响及作用机制。
方法将miR-581 mimics和miR-581 NC转染到卵巢癌SKOV3细胞中，实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测转染效率；转染成功后，Western blot检测转染后卵巢癌SKOV3细胞中自噬相关蛋白的表达水平；TargetScanHuman数据库预测miR-581靶基因，Western blot验证miR-581与靶基因的作用。
结果过表达miR-581后可显著抑制自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达（P < 0.01）；miR-581可负向调控FOXO1的表达（P < 0.01）；FOXO1促进卵巢癌SKOV3细胞自噬（P < 0.05）。
结论miR-581通过调控FOXO1的表达影响卵巢癌SKOV3细胞自噬。
Abstract:ObjectiveTo explore the effect and mechanism of miR-581 on the autophagy of ovarian cancer SKOV3 cells.
MethodsmiR-581 mimics and miR-581 NC were transfected into SKOV3 cells, and the transfection efficiency was detected by qRT-PCR. After successful transfection, Western blot was used to detect autophagy-related proteins expression in SKOV3 cells. TargetScanHuman database predicted miR-581 target genes, and Western blot verified the role of miR-581 and target genes.
ResultsOverexpression of miR-581 significantly inhibited the expression of autophagy-related proteins LC3 Ⅱ and Beclin1 (P < 0.01); miR-581 negatively regulated FOXO1 expression (P < 0.01) and FOXO1 promoted autophagy of SKOV3 cells (P < 0.01).
ConclusionmiR-581 affects the autophagy of ovarian cancer SKOV3 cells by regulating the expression of FOXO1.
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Key words:
- Ovarian cancer /
- SKOV3 cells /
- Autophagy /
- miR-581 /
- FOXO1
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0 引言
卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，具有隐匿性，严重威胁女性健康。尽管卵巢癌的治疗效果在细胞减灭术和化疗方面有所改善，但常在癌症晚期被诊断为转移和化疗耐药，5年总存活率不到30%[1]。自噬是真核细胞中高度保守的生物学行为，可在缺氧、饥饿或极端pH值等条件下激发，分解细胞不必要或丧失功能的成分，一旦缺失或过度激活则可能引起一系列病理改变[2]。研究证实，多种肿瘤的发生、发展及耐药都与自噬有着密不可分的联系。在卵巢癌中，自噬水平下调，促进自噬有助于抑制卵巢癌的发展[3]。自噬在卵巢癌SKOV3细胞中的发生机制仍未阐明，亟需深入探索其生物学机制。MicroRNAs（MiRNAs）是一种由18~22个核苷酸组成的非编码RNA，在转录后抑制信使RNA的表达。近期研究表明，miR-581与胆管癌、结直肠癌和食管鳞癌的增殖及转移相关，也能够在胃癌的发展过程中发挥作用[4-7]。因此本研究拟探究miR-581在卵巢癌SKOV3细胞自噬中的作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人卵巢癌细胞系SKOV3购自BNCC（北纳生物，河南）公司。RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗、0.25%胰酶均购自美国Gibco公司。miR-581 mimics、miR-581 NC以及miR-581引物和U6内参引物的设计及合成均由广州锐博生物科技有限公司完成。LC3抗体、Beclin1抗体、GAPDH抗体、FOXO1抗体均购自CST（美国）。miRNA提取试剂盒购自OMEGN公司（北京）。反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒均购自广州锐博生物科技有限公司。蛋白裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。ECL发光液购自天根生化科技有限公司（北京）。质粒转染试剂盒Lip3000购自美国Thermo公司。FOXO1抑制剂AS1842856购自MCE公司（上海）。二氧化碳培养箱购自美国Heal-Force公司。ABI Step One Plus Real-Time PCR System购自美国应用生物系统公司。UVP BioSepctrum 610成像系统购自UVP美国紫外线制品有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
SKOV3细胞株在RPMI 1640完全培养基、37℃、5%CO2培养箱中培养，RPMI 1640完全培养基包含10%胎牛血清，1%双抗。培养基根据细胞生长状态进行更换，待细胞密度为70%~80%时，对细胞进行消化、传代和接种。
1.2.2 细胞分组
在检测miR-581过表达的SKOV3细胞构建时，观察miR-581对自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1表达的影响和观察miR-581对靶基因FOXO1的影响，分别将细胞分为Control、miR-581 NC和miR-581 mimics组；在观察靶基因FOXO1对自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1表达的影响时，将细胞分为Control和AS1842856组；在观察miR-581通过靶基因FOXO1对自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1表达的影响时，将细胞分为Control、AS1842856、miR-581 mimics和miR-581 mimics+AS1842856组。上述分组，提取RNA时，转染组作用时间均为24 h；提取蛋白时，转染组作用时间均为48 h；AS1842856作用时间为24 h，且在miR-581 mimics+AS1842856组中AS1842856提前1 h加入。
1.2.3 细胞转染
将对数生长期的SKOV3细胞按照每毫升2.5×105个接种于6孔板中，待细胞密度为50%~60%时，根据Lip3000转染试剂说明书将miR-581 mimics及miR-581 NC转染进SKOV3细胞，放入细胞培养箱中继续培养至相应的时间。
1.2.4 实时荧光定量PCR检测miR-581表达量
将Control、miR-581 NC和miR-581 mimics三组细胞根据说明书分别提取miRNA，使用反转录试剂盒合成cDNA并作为模板进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）扩增，检测转染后miR-581的表达情况。所有反应均设3个复孔，SYBR Green嵌合荧光方法在荧光定量PCR仪上扩增目的基因和内参基因。以U6为内参基因，miR-581的相对定量用2-∆∆ct法。
1.2.5 Western blot检测相关蛋白表达水平
将Control、miR-581 NC、miR-581 mimics、AS1842856、miR-581 mimics+AS1842856五组细胞根据说明书提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测试盒测定并将样品调定至统一浓度，加蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min使蛋白变性，分装后于-80℃冰箱保存。取30 μg总蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至NC膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入用抗体稀释液稀释的特异性一抗LC3、Beclin1、FOXO1、GAPDH（1:1 000），4℃过夜。次日用TBST洗涤3次，每次10 min。放入稀释好的二抗中（1:2 000），室温孵育1 h，用TBST再次洗涤3次，每次10 min。ECL法显影，采用凝胶成像系统进行拍照，计算灰度值。以GAPDH为内参，观察各组检测蛋白的表达情况。
1.3 统计学方法
采用SPSS23.0软件进行统计学分析，实验数据为正态分布，采用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实时荧光定量PCR检测miR-581过表达的SKOV3细胞的构建
与Control组相比，miR-581 NC组miR-581的表达变化不明显（P > 0.05）；miR-581 mimics组明显升高（P < 0.05）；与miR-581 NC相比，miR-581 mimics组也明显升高（P < 0.05），以上结果表明miR-581过表达的SKOV3细胞的构建成功，见图 1。
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图 1 miR-581 mimics及miR-581 NC的转染效率*: P < 0.05, compared with the control group; #: P < 0.05, compared with the miR-581 NC group.Figure 1 Transfection efficiency of miR-581 mimics and miR-581 NC2.2 过表达miR-581对卵巢癌SKOV3细胞自噬相关基因表达的影响
Western blot结果显示，与Control组相比，miR-581 NC组Beclin1、LC3Ⅱ表达量差异无统计学意义（均P > 0.05）；与Control和miR-581 NC组相比，miR-581 mimics组Beclin1、LC3Ⅱ表达量均明显降低（均P < 0.01），表明过表达miR-581能够抑制卵巢癌SKOV3细胞自噬的发生，见图 2。
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图 2 过表达miR-581抑制自噬相关蛋白的表达**: P < 0.01, compared with the control group; ##: P < 0.01, compared with the miR-581 NC group.Figure 2 Overexpression of miR-581 inhibited expression of autophagy-related proteins2.3 过表达miR-581对FOXO1蛋白表达的影响
根据TargetScanHuman数据库预测显示FOXO1的3’UTR含有2处与miR-581互补的序列，见图 3，FOXO1可能为miR-581的靶基因。进一步Western blot验证结果显示，与Control组相比，miR-581 NC组FOXO1表达量无明显变化（P > 0.05）；与Control和miR-581 NC组相比，miR-581 mimics组FOXO1表达量明显降低（均P < 0.01）。表明过表达miR-581能够抑制FOXO1的表达，见图 4。
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图 3 FOXO1的3’UTR包含2个与miR-581互补的序列(TargetScanHuman数据库)Figure 3 3'UTR of FOXO1 contained two complementary sequences to miR-581 (TargetScanHuman database)![]()
图 4 过表达miR-581抑制FOXO1蛋白的表达**: P < 0.01, compared with the control group; ##: P < 0.01, compared with the miR-581 NC group.Figure 4 Overexpression of miR-581 inhibited FOXO1 protein expression2.4 FOXO1对卵巢癌SKOV3细胞自噬相关基因表达的影响
Western blot结果显示，与Control组相比，加入AS1842856后，LC3Ⅱ和Beclin1表达水平明显降低（P < 0.05），表明FOXO1能够促进卵巢癌SKOV3细胞自噬的发生，见图 5。
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图 5 FOXO1促进卵巢癌SKOV3细胞自噬相关蛋白的表达*: P < 0.05, compared with the control group.Figure 5 FOXO1 promoted expression of autophagy-related proteins in SKOV3 cells2.5 miR-581通过FoxO1影响卵巢癌细胞自噬
Western blot结果显示，与Control组相比，AS1842856组及miR-581 mimics组自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达下调（P < 0.05、P < 0.01），miR-581 mimics+AS1842856组自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达下调（P < 0.01、P < 0.01）；与AS1842856组相比，miR-581mimics+AS1842856组自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达下调（P < 0.05、P < 0.01）；与miR-581mimics组相比，miR-581 mimics+AS1842856组自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达下调（P < 0.05、P < 0.01），表明miR-581通过FOXO1影响卵巢癌细胞自噬，见图 6。
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图 6 miR-581通过FOXO1影响卵巢癌细胞自噬1: Control; 2: AS1842856; 3: miR-581 mimics; 4: miR-581 mimics+AS1842856; a: P < 0.05, aa: P < 0.01, b: P < 0.05, bb: P < 0.01, cc: P < 0.01, compared with control group; *: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with AS1842856 group; #: P < 0.05, ##: P < 0.01, compared with miR-581 mimics group.Figure 6 miR-581 affected autophagy of ovarian cancer cells through FOXO13 讨论
卵巢癌位于女性癌症性死亡的第五位，也是发达国家中最致命的妇科恶性肿瘤[8]。虽然卵巢癌的治疗手段有所提高，但在过去的20年里，卵巢癌患者的生存率并没有得到改善[9]。靶向治疗能影响肿瘤细胞、基质、血管或细胞信号转导通路[10]，因此，靶基因的发现可能为卵巢癌的治疗提供新方向，进一步改善患者的生存率。
2006年首次证明miRNA与癌症的发生相关[11]。miRNA在癌症中的作用主要通过调控靶基因的表达来影响多种生物过程，包括增殖、分化、细胞周期、凋亡和免疫应答等[12]。近年来研究发现卵巢癌中差异表达的miRNA通过调控靶基因影响卵巢癌细胞自噬的发生[13]。
自噬是细胞内一种自我消化的过程，是维持细胞内稳态的重要途径，在细胞增殖、分化和衰老中发挥重要作用[14]。随着对自噬研究的深入了解，人们意识到自噬在肿瘤中的作用是一把双刃剑，它既可以促进也可以抑制肿瘤的发生，这取决于细胞环境和疾病阶段[15]。例如，在肿瘤发生的早期阶段，自噬水平的降低可促进癌细胞增殖，刺激自噬可能有益于癌症预防[16-17]。在近年来的研究中，多种类型的肿瘤细胞内均存在自噬水平的改变，如肺癌、乳腺癌、肝细胞癌等[14]。自噬在卵巢癌进展中的机制可能与自噬相关信号通路的激活或抑制、自噬相关的抑癌基因突变或缺失以及miRNAs的异常表达有关[3]。本实验结果表明，过表达miR-581抑制卵巢癌SKOV3细胞自噬。
有研究发现miR-581通过靶基因SMAD7、影响结直肠癌细胞转移[5]。miR-581在卵巢癌中的作用机制尚未阐明。FOXO1是叉头盒O（FOXO）家族成员，在肿瘤中具有重要的调控作用[18]。而最近研究发现FOXO1是不同细胞类型和疾病条件下调节自噬的关键介质[19]。如李云等[20]研究发现幽门螺杆菌VacA能够通过增加FOXO1蛋白的表达促进胃癌细胞的自噬。AS1842856是FOXO1的特异性抑制剂，有文献报道AS1842856仅通过与FOXO1结合而降低FOXO1活性，而不影响其转录和蛋白质表达[21]。本实验结果显示，加入抑制剂后，自噬相关蛋白表达减少，FOXO1表达变化不明显。TargetScanHuman数据库预测及Western blot结果显示，FOXO1为miR-581的靶基因，并且过表达的miR-581通过调控FOXO1的表达来影响卵巢癌细胞自噬。
综上，本实验在卵巢癌细胞水平上证明了过表达miR-581可抑制FOXO1的表达，进而抑制自噬的发生，为卵巢癌SKOV3细胞自噬的发展提供了新的理论机制，可能成为卵巢癌治疗的新靶点。
Competing interests:The authors declare that they have no competing interests作者贡献：高海宁：实验设计、实施及文章撰写白瑞霞、赵鹏伟：实验设计、评估及文章审校宋婉莹、林萱：部分实验操作 -
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图 1 miR-581 mimics及miR-581 NC的转染效率
Figure 1 Transfection efficiency of miR-581 mimics and miR-581 NC
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图 2 过表达miR-581抑制自噬相关蛋白的表达
Figure 2 Overexpression of miR-581 inhibited expression of autophagy-related proteins
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图 3 FOXO1的3’UTR包含2个与miR-581互补的序列(TargetScanHuman数据库)
Figure 3 3'UTR of FOXO1 contained two complementary sequences to miR-581 (TargetScanHuman database)
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图 4 过表达miR-581抑制FOXO1蛋白的表达
Figure 4 Overexpression of miR-581 inhibited FOXO1 protein expression
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图 5 FOXO1促进卵巢癌SKOV3细胞自噬相关蛋白的表达
Figure 5 FOXO1 promoted expression of autophagy-related proteins in SKOV3 cells
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