0   引言

喉癌是头颈部常见的肿瘤之一，主要起源于喉部黏膜的上皮组织，并且大多数是鳞状细胞癌^[1]。虽然相对于其他肿瘤来说，喉癌的发病率和死亡率较低，但是无论是在中国还是其他国家均呈上升趋势^[1-4]。喉癌常见的危险因素有许多，包括吸烟、胃食管反流、饮酒和石棉暴露^[5]。尽管喉癌的诊断和治疗方法有了不断改进，但由于喉癌发病隐匿并且复发率很高，因此，患者总体生存率并没有得到明显提高^[6]。这就需要更加有效的预测和治疗的靶点。

在过去的几年里，对细胞焦亡的研究越来越多。焦亡是一种由炎性小体触发的炎性细胞死亡，可导致细胞肿胀，质膜溶解，染色质碎裂和细胞内促炎内容物的释放。据报道，焦亡与动脉粥样硬化等疾病密切相关^[7-8]。近年来，研究发现焦亡在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。因此，通过诱导肿瘤细胞发生焦亡将为肿瘤的治疗开辟新的途径^[9]。另外，lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的RNA转录本。LncRNA虽然不编码蛋白质，但是它可以通过调节基因的表达参与肿瘤发生和发展过程^[10]。目前，关于焦亡相关lncRNA的研究很少。最近的一项研究表明，lncRNA HOTTIP在卵巢癌中的表达显著上调，并且沉默HOTTIP后可导致NLRP1炎性反应小体介导的焦亡^[11]。同样，沉默lncRNA SNHG可以诱导肝癌细胞发生焦亡^[12]。

因此本研究拟基于TCGA数据构建与焦亡相关lncRNA的预后模型，并对该模型的预测能力进行验证，通过GSEA富集预测该模型可能参与的信号通路。结果表明这种新的预后模型可以很好地预测喉癌的预后，从而有助于确定治疗靶点和生物标志物，现报道如下。

1   资料与方法

1.1   数据收集

从TCGA数据库（http://tcgadata.nci.nih.gov/）中获取喉癌患者的转录组和临床资料数据（12例正常组织和111例癌组织）。然后从MSigDB数据库（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）和文献^[13]中获得了57个焦亡相关的基因。

1.2   获取差异表达的与焦亡相关lncRNA

采用Spearman相关性检验评估焦亡基因与相关lncRNA之间的关系。相关系数 > 0.4并且P < 0.01。使用Wilcox秩和检验得到差异表达的与焦亡相关lncRNA（FDR < 0.05, |logFC| > 1）。

1.3   建立预后模型

首先，将上述获得的lncRNA进行单因素Cox分析，获得与预后有关的lncRNA（P < 0.05）。随后，使用多因素Cox逐步回归法构建预后模型。依据每个lncRNA的回归系数，构建风险评分方程：风险评分=β1×lncRNA_1EXP+β2×lncRNA_2EXP+......+βn×lncRNA_nEXP，式中β为相应lncRNA的回归系数，lncRNA_EXP为相应lncRNA的表达量^[14]。依据风险评分的中位值，将喉癌患者分为低风险组和高风险组。Kaplan-Meier生存曲线验证风险评分与患者总生存的关系。采用ROC曲线比较预后模型的准确性。使用R软件的“pheatmap”包绘制预后模型中lncRNA表达热图。将临床数据与风险评分数据合并进行独立预后分析。此外，使用Cytoscape3.6.0可视化lncRNA与焦亡基因之间的互作关系。

1.4   基因富集分析

使用GSEA4.0.0进行富集分析，首先根据风险评分的中位值将其分成高、低风险组。选用GSEA中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt数据集作为内参照，运用缺省加权富集统计方法进行富集分析并设置1 000次随机组合。

1.5   统计学方法

数据分析使用R4.0.0和SPSS24.0。两组之间的差异比较使用Wilcoxon检验进行分析。基于FDR并采用Benjamini-Hochberg法进行校正鉴定表达差异的lncRNA。使用ROC曲线评估预后模型的敏感度和特异性。Spearman相关检验分析基因表达间的相关性。生存曲线比较采用Kaplan-Meier法和Log rank检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   焦亡相关lncRNA预后基因集

共发现483个与焦亡相关的lncRNA。单因素Cox分析确定了23个有预后价值的焦亡相关lncRNA，将这23个lncRNA纳入多因素Cox逐步回归分析中。最终，有10个焦亡相关lncRNA被认为是喉癌的独立预后预测因子，见表 1。计算10个lncRNA的风险评分并构建了预后模型，并使用R软件的“pheatmap”包绘制预后模型中lncRNA表达热图，见图 1。

表  1  预后模型中的10个lncRNAs

Table  1  Ten lncRNAs in prognostic model

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图  1  预后模型中lncRNA表达热图

Figure  1  Heat map of lncRNA expression in prognostic model

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2.2   高风险组与较差的生存有关

Kaplan-Meier分析显示高风险组与较差的生存率相关（P < 0.001），见图 2A。风险生存状态图提示：风险评分与喉癌患者的生存率成反比，见图 2B。新的lncRNA预后模型对喉癌1、3、5年生存率的AUC预测值分别为0.864、0.866和0.806，见图 2C。单因素分析显示，风险评分（HR=1.075, 95%CI: 1.045~1.107, P < 0.001）和性别（HR=0.292, 95%CI: 0.133~0.641, P=0.002）有统计学意义；多因素Cox分析显示，风险评分（HR=1.056, 95%CI: 1.022~1.092, P=0.001）和性别（HR=0.351, 95%CI: 0.128~0.968, P=0.043）同样具有统计学意义，提示风险评分和性别是影响喉癌患者总生存率的独立预后因素，见图 3A~B。预后模型中lncRNA与mRNA的作用关系，见图 3C，其中AC015911.3所调控的焦亡基因数目最多，处于核心地位，推测其可能在喉癌发生焦亡的过程中扮演著重要角色。结合临床病理特征和新的焦亡相关lncRNA预后模型的列线图进一步证明了该预测模型的稳定性和准确性，即风险评分越高，患者的生存越差，见图 3D。综上所述，该预后模型可应用于喉癌患者的临床诊断和治疗。

图  2  基于TCGA的焦亡相关lncRNA预后模型

Figure  2  Prognostic model of pyroptosis-associated lncRNAs based on TCGA

A: Kaplan-Meier curve results; B: risk survival state diagram; C: ROC curve prediction of 1, 3 and 5-year survival rates of laryngeal cancer.

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图  3  危险评分与临床资料的单因素和多因素Cox分析

Figure  3  Univariate and multivariate Cox analyses of risk scores and clinical data

A: univariate Cox analysis; B: multivariate Cox analysis; C: relationship between lncRNA and mRNA expression in prognostic models. Green nodes indicated lncRNAs and red nodes represented pyroptosis genes; D: nomograms of clinical data and risk scores.

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2.3   富集分析

为探究风险评分相关的生物学通路，对高、低分析组进行了基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），结果表明，低风险组样本显著富集到缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解（FDR=0.145, P=0.002）和丁酸甲酯代谢（FDR=0.196, P < 0.001）等基因集，见图 4。因此，焦亡相关lncRNA可能通过调节癌细胞代谢相关通路进而调控其增殖。

图  4  基因集富集分析结果

Figure  4  GSEA enrichment analysis results

A: butanoate metabolism; B: degradation of valine, leucine and isoleucine.

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3   讨论

焦亡可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感度，为肿瘤的治疗指明了新的方向。在本研究中，首先基于TCGA数据库确定了与焦亡相关预后lncRNA，并建立了喉癌的预后模型。然后使用GSEA对高、低危险组进行了通路富集分析。本研究发现了焦亡信号通路中潜在的肿瘤标志物和治疗靶点。

本研究发现10个差异表达的焦亡相关lncRNA是喉癌的独立预后因素。近期的研究发现甲状腺癌中过表达的LINC02454可以抑制甲状腺癌细胞发生凋亡并促进其增殖，与肿瘤体积和淋巴结转移密切相关^[15]。在鼻咽癌、食管癌和骨肉瘤中，NKILA可以作为抑癌基因通过调节NF-κB信号通路抑制肿瘤的进展^[16-18]。同样，NKILA在喉癌中的低表达与喉癌患者较短的总生存期有关，并且敲降NKILA可以抑制NF-κB的活化，降低了X-射线辐射对喉癌细胞的细胞毒性^[19]。在一项相关性研究中发现在骨肉瘤中表达上调的ERICD与预后不良有关，并通过E2F1与ARID3A相互作用，调控骨肉瘤细胞的迁移和增殖^[20]。MIR9-3HG是原发性胶质母细胞瘤的保护因素^[21]。然而，关于焦亡相关lncRNA在喉癌预后中的价值研究甚少。

本研究利用焦亡相关lncRNA构建预后模型，并计算出每例患者的危险评分，按照风险评分的中位值将所有患者分为高、低风险两组，以探讨他们在喉癌中的潜在作用。利用GSEA软件进行富集分析发现缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解和丁酸甲酯代谢等基因集显著富集到低风险组。研究发现，3-羟基异丁基CoA水解酶作为缬氨酸分解代谢的关键酶，在被抑制后可以控制结直肠癌的进展^[22]。此外，生长因子激活的PI3K/Akt信号通路通过LAT3调节前列腺癌细胞系中亮氨酸的转运，这能使前列腺癌细胞系快速摄取亮氨酸以促进细胞生长^[23]。总之，焦亡相关lncRNA可能通过调节癌细胞代谢调控其增殖。

焦亡是一种新的细胞死亡形式，可能为肿瘤治疗提供新的途径。然而，许多关键问题仍然没有解决，如焦亡和其他细胞死亡之间的联系，以及如何通过调节癌细胞代谢影响癌细胞的生长。因此，本研究的探索有助于预测与喉癌预后有关的焦亡相关lncRNA的生物标志物，为相关疾病的治疗提供依据。本研究还有许多不足，如样本量不足，还需要使用不同的队列进行验证；研究结果没有经过临床样本的验证，可靠性无法得到充分保证。