0   引言

食管癌（esophageal cancer, EC）是常见的消化道恶性肿瘤，居全球癌症相关死亡原因的第六位^[1]。我国属于食管癌的高发地区，据统计2014年全球新发食管癌病例约有45.6万例，死亡病例40万例，其中超过50%的病例发生在我国^[2]。西方国家食管腺癌高发，而我国食管鳞癌的发病更为多见^[3]。临床治疗主要依靠手术，尽管各种治疗方法不断发展，但食管癌的5年生存率为10%~15%^[4]，目前尚缺乏新型治疗靶点。因此，研发新型治疗靶点对食管癌的诊疗具有重大意义。

干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）是细胞分泌的一类功能性蛋白，具有抗病毒、抑制细胞分裂、诱导细胞分化和增强细胞吞噬功能^[5]。此外，IFN-γ通过激活其信号通路发挥免疫刺激和免疫调节作用。越来越多的证据表明IFN-γ具有抗肿瘤作用，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、增强抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤血管生成^[6]。有研究报道IFN-γ可抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移能力并下调CXCL8的表达^[7]。趋化因子CXC基序配体8（CXC motif ligand 8, CXCL8），又称白介素-8（interleukin 8, IL-8），主要由巨噬细胞、上皮细胞、气道平滑肌细胞和内皮细胞等分泌，是炎性反应和免疫系统的重要成分，且与多种肿瘤的转移、侵袭、血管生成有一定的相关性^[8-10]。但CXCL8在食管癌中的作用尚不明确。本研究旨在探讨IFN-γ对食管鳞癌细胞增殖、迁移的影响及其调控CXCL8的可能，为食管鳞状细胞癌提供新的诊疗思路。

1   材料与方法

1.1   细胞株及主要试剂

人食管癌细胞株Eca9706、TE1、KYSE30、KYSE150细胞由河北医科大学第四医院科研中心保存。高糖培养基DMEM和RPMI Medium 1640培养基（含L-谷氨酰胺）均购自美国Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自中国ExCell Bio公司，PBS缓冲液购自以色列BI公司，TRIzol试剂购自日本TaKaRa公司，Real-time qPCR试剂购自广州复能基因有限公司，RT-PCR试剂盒购自加拿大Abm公司，ELISA试剂盒购自武汉BOSTER公司，引物由上海生工公司合成，重组人干扰素-γ冻干粉购自上海凯茂生物医药有限公司。

1.2   细胞培养与CXCL8表达鉴定

用含有1%的青霉素（10 000 u/ml）和链霉素（10 000 μg/ml）的双抗和10%胎牛血清的DMEM完全培养基常规培养Eca9706、TE1、KYSE150细胞，用含有1%的青霉素（10 000 u/ml）和链霉素（10 000 μg/ml）的双抗和10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养KYSE30细胞，待细胞长至对数生长期时提取总RNA，反转成cDNA后，以GAPDH为内参使用RT-PCR检测各细胞株CXCL8的表达量。

1.3   干扰素-γ作用于Eca9706细胞

Eca9706细胞常规培养，待细胞密度达到70%~80%时，用胰酶将其消化，收集细胞后计数，按每孔1.0×10⁵个的细胞数铺6孔板，每孔培养基体积为2 ml，继续过夜培养，当细胞汇合度达50%左右时，加入IFN-γ。IFN-γ每瓶为1×10⁷IU，用200 μl的PBS溶解备用。设3个处理组，各组依次加入0、10、100 μl的IFN-γ溶液，各组干扰素-γ浓度为0 IU/ml、25 000 IU/ml、250 000 IU/ml，各处理组设一个复孔。加药后继续培养24 h，提取各处理组细胞的RNA，反转后做Quantitative Real-time PCR检测各处理组CXCL8的表达量。

1.4   ELISA实验检测IFN-γ对CXCL8的作用效果

设3个处理组，细胞培养同1.3，各处理组依次加入0、10、100 μl的IFN-γ溶液作用48 h后收集Eca9706细胞培养的上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞培养上清液中CXCL8的含量。

1.5   CCK8实验检测IFN-γ对Eca9706细胞增殖能力的影响

设2个处理组，培养条件同1.3，分别加入0、100 μl的IFN-γ溶液作用24 h后的细胞，消化制成3.0×10⁴/ml的悬液，每孔100 μl细胞悬液加入96孔板，过夜培养，待细胞贴壁后，加入CCK8试剂，在0、24、48、72 h后，使用酶标仪，检测450 nm波长下的光密度（OD）值，代表细胞的增殖水平。

1.6   划痕实验检测IFN-γ对Eca9706细胞迁移能力的影响

设3个处理组，培养条件同1.3，当细胞铺满孔底时，用10 μl的移液器头在孔底中间部位划3道细痕，PBS清洗后，加入2 ml不含胎牛血清的DMEM培养基，各处理组依次加入0、10、100 μl的IFN-γ溶液。继续培养24 h后，显微镜下观察细胞迁移距离并拍照记录，通过ImageJ软件，计算划痕处的面积变化。划痕愈合率（%）=[（0h划痕面积-24h划痕面积）/0h划痕面积]×100%。

1.7   Transwell实验检测IFN-γ对Eca9706细胞迁移能力的影响

将Eca9706细胞悬于无血清的DMEM培养基中制成单细胞悬液，显微镜下计数。设3个处理组，各组上室中每孔加入5×10⁴个细胞，再依次加入0、1、10 μl的IFN-γ溶液后以无胎牛血清培养基补齐200 μl，下室加入600 μl含10%胎牛血清的培养基，培养72 h后，取出上室弃去培养基，用棉签拭去膜上面未穿过的细胞。PBS清洗后，甲醇固定，结晶紫染色，晾干后于显微镜下拍照。随机选取5个区进行细胞计数。

1.2~1.7实验均重复3次。

1.8   统计学方法

应用SPSS25.0版本进行统计分析。数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析和t检验。P < 0.05被认为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   IFN-γ作用后Eca9706细胞形态未发生明显变化

IFN-γ作用24 h后，与对照组（NC组）相比较，IFN-γ（250 000 IU/ml）作用后的处理组细胞形态并未发生明显变化，见图 1。

图  1  IFN-γ作用24h Eca9706细胞形态(×100)

Figure  1  Morphology of Eca9706 cells after IFN-γ treatment for 24h (×100)

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2.2   IFN-γ抑制Eca9706细胞的增殖能力

CCK8实验结果显示，IFN-γ（250 000 IU/ml）抑制Eca9706细胞的增殖能力，在各检测时间点两组细胞增殖率差异有统计学意义（P=0.0037），见图 2。

图  2  IFN-γ抑制Eca9706细胞的增殖能力

Figure  2  IFN-γ inhibited proliferation of Eca9706 cells

^**: Compared with NC group, P < 0.01.

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2.3   IFN-γ抑制Eca9706细胞的迁移能力

细胞划痕实验和Transwell实验结果显示，与NC组相对比，IFN-γ作用后的处理组划痕愈合率和穿膜细胞数均显著降低（P=0.00011，P=0.00013）。划痕愈合率为：NC组（22.53±0.13）%、IFN-γ（25 000 IU/ml）组（19.73±0.58）%、IFN-γ（250 000 IU/ml）组（5.8±0.43）%；Transwell穿膜细胞数为：NC组（311±12）个、IFN-γ（25 000 IU/ml）组（35±6）个、IFN-γ（250 000 IU/ml）组（7±2）个，见图 3。

图  3  IFN-γ减弱Eca9706细胞迁移能力(×100)

Figure  3  IFN-γ reduced migration ability of Eca9706 cells (×100)

A: cell scratch experiment; B: transwell experiment.

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2.4   CXCL8基础表达率鉴定

RT-PCR法检测结果显示，TE1细胞中CXCL8表达水平比Eca9706高（P=0.0003），KYSE30、KYSE150细胞中CXCL8表达水平低于Eca9706细胞（P=0.0008）；各细胞株CXCL8相对表达量分别为：Eca9706（1.05±0.15）、TE1（2.44±0.15）KYSE30（0.88±0.18）、KYSE150（0.21±0.07），见图 4。CXCL8在此四种食管癌细胞中均有表达。

图  4  RT-PCR法检测四种食管癌细胞中CXCL8的相对表达

Figure  4  Relative expression of CXCL8 in four esophageal cancer cells detected by RT-PCR

^**: P < 0.01, compared with Eca9706 cells.

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2.5   IFN-γ抑制Eca9706细胞CXCL8的表达

Quantitative Real-time PCR检测结果显示，与阴性对照组（NC组）比较，IFN-γ（25 000 IU/ml）组和IFN-γ（250 000 IU/ml）组CXCL8的相对表达量均明显下调（P=0.0089），IFN-γ（25 000 IU/ml）组为（0.52±0.03），IFN-γ（250 000 IU/ml）组为（0.78±0.01），见图 5。

图  5  不同浓度IFN-γ处理后Eca9706细胞CXCL8的表达

Figure  5  Relative expression of CXCL8 in Eca9706 cells after different concentrations of IFN-γ treatment

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2.6   IFN-γ抑制Eca9706细胞CXCL8的分泌

ELISA结果显示，与NC组相比，IFN-γ（25 000 IU/ml）组和IFN-γ（250 000 IU/ml）组的CXCL8分泌量水平均明显降低（P=0.0353），NC组为（57.6±1.0）pg/ml、IFN-γ（25 000 IU/ml）组为（46.1±3.9）pg/ml，IFN-γ（250 000 IU/ml）组为（49.8±0.3）pg/ml。

3   讨论

食管癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一，其5年生存率普遍较低，手术切除是食管癌患者的最佳治疗方法，然而，由于食管癌患者的血管侵袭和转移率高，尽管放疗和化疗可能在一定程度上延长生存期，但总体疗效有限，对于接受标准治疗无效的食管癌患者，目前尚无有效的治疗方案^[11]。在这种情况下，开发新型治疗靶点对食管癌的诊疗具有重大意义。

IFN-γ是一种细胞因子，在细胞介导的适应性免疫应答过程中，它能引起细胞毒性效应并作为免疫刺激剂或调节剂，许多研究表明，IFN-γ具有抗肿瘤活性，并已用于临床治疗多种恶性肿瘤^[12-14]。由于其在肿瘤免疫监测和细胞毒性方面的重要作用，IFN-γ在胰腺癌的治疗中表现出有效性。Zhang等^[15]研究发现IFN-γ可抑制CXCL8-CXCR2轴介导的肿瘤相关巨噬细胞向肿瘤部位的转移并增强胰腺癌中抗-PD1的疗效。Long等^[16]证明，肿瘤部位纤维化和大量的巨噬细胞浸润是胰腺癌的最大治疗障碍，IFN-γ可以通过上调基质金属蛋白酶，从而使肿瘤浸润的巨噬细胞重新分布改善纤维化，Shibuya等^[17]证明胰腺导管腺癌中存在多种浸润效应细胞和调节性免疫细胞，IFN-γ提高了肿瘤内抗原特异性辅助性T细胞的水平，降低了调节性T细胞的水平，Lutz等^[18]报道IFN-γ可增强肿瘤疫苗的免疫原性，促进抗原特异性辅助性T细胞的应答。

在本研究中，我们首次证实IFN-γ抑制食管鳞癌Eca9706细胞的增殖和迁移能力。与肿瘤细胞增殖和转移相关的CXCL8 mRNA表达在IFN-γ处理后的细胞中显著降低。在甲状腺癌中IFN-γ同样能抑制CXCL8的表达和分泌^[19]。CXCL8是一种促炎性CXC趋化因子，具有趋化中性粒细胞游走和促进其脱颗粒的作用^[9]。CXCL8及其受体（CXCR1和CXCR2）在癌细胞、内皮细胞、浸润性中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞中的表达增加，表明CXCL8是肿瘤微环境中的一个重要调节因子，CXCL8信号通路的激活促进内皮细胞的血管生成反应，增加癌细胞的增殖和迁移^[20-22]。Zhang等^[7]研究发现在胰腺癌BxPC-3细胞中IFN-γ通过RhoGDI2/Rac1/NF-κB信号通路下调CXCL8的表达和分泌，从而抑制BxPC-3细胞诱导的增殖和迁移。该研究为我们进一步研究IFN-γ在食管鳞癌Eca9706细胞下调CXCL8的作用机制提供了理论指导。

综上所述，本研究提供了IFN-γ可下调食管鳞癌Eca9706细胞中CXCL8的表达，并抑制其增殖和迁移能力的证据，为今后更深入研究IFN-γ在食管鳞状细胞癌的侵袭转移和临床治疗中的作用及机制奠定了实验基础。